© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 7/2012, s. 549-552
Agata Gieleżyńska, *Jadwiga Fabijańska-Mitek
Porównanie dwóch ilościowych metod mikroskopowej oceny krwawienia płodowo-matczynego
Comparison of two quantitative methods of microscopic feto-maternal haemorrhage evaluation**
Department of Immunohaematology, Medical Centre of Postgraduate Education, Warsaw
Head of Department: Jadwiga Fabijańska-Mitek, PhD
Streszczenie
Wprowadzenie. Ilościowa ocena krwawienia płodowo-matczynego (FMH) ma zasadnicze znaczenie dla ustalenia odpowiedniej dawki Ig anty-RhD w immunoprofilaktyce choroby hemolitycznej płodu i noworodka u RhD ujemnych matek. Test Kleihauera-Betke (K-B) jest jedną z metod wprowadzoną do naszego laboratorium w celu badania FMH. W niektórych krajach jest on stosowany rutynowo od wielu lat, a w Polsce tylko wyjątkowo. Oparty jest na różnych własnościach hemoglobiny F (HbF) w krwinkach czerwonych płodu i hemoglobiny A (HbA) w krwinkach matki. HbF jest bardziej odporna na alkaliczną denaturację i kwaśną elucję niż HbA.
Materiał i metody. Wysuszone i zabarwione rozmazy krwinek czerwonych po denaturacji i kwaśnej elucji oceniano ilościowo dwiema metodami. W pierwszej liczono 2 x krwinki płodowe wśród 1000 „cieni” krwinek matki (dwa szkiełka), w drugiej oceniano co najmniej 10 000 krwinek stosując siatkę Millera. Postępowanie przeprowadzono po 10 razy dla mieszanin: 0,1%, 0,25%, 0,5%, 1%, 2%, krwinek płodowych w krwi osób dorosłych, które imitowały FMH.
Wyniki. Współczynniki zmienności (WZ) były odpowiednie w drugiej metodzie odczytu (< 20%) i obliczone objętości FMH odpowiadały rzeczywistym objętościom w dopuszczalnym zakresie. Te wartości nie były prawidłowe w pierwszej metodzie odczytu (WZ od ok. 30% do 100%).
Wnioski. K-B może być czułą metodą ilościową badania FMH, jeśli w odczycie ocenia się co najmniej 10 000 krwinek czerwonych.
Summary
Introduction. Quantification of feto-maternal haemorrhage (FMH) is essential for determination of an accurate dose of anti-RhD Ig in immunoprophylaxis of haemolytic disease of foetus and newborn in RhD negative mothers. The Kleihauer-Betke (K-B) test is one of some methods introduced to our laboratory for FMH investigation. In some countries it has been used routinely for many years, but in Poland only occasionally. K-B test is based on the different properties of haemoglobin F (HbF) in fetal red blood cells (RBCs) and haemoglobin A (HbA) in maternal RBCs. HbF is more resistant than HbA to both alkali denaturation and acid elution.
Material and methods. Dried and stained blood films were examined using two quantitative methods: in the 1st of them we counted twice (2 slides) foetal RBCs between 1000 maternal “ghost” cells, in the 2nd we evaluated at least 10 000 cells, using a Miller square. These methods were performed 10 times for each prepared mixtures with 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1% and 2% of foetal RBCs in adult blood, imitating FMH.
Results. Coefficients of variation (CV) were appropriate in the 2nd method (< 20%) and estimated volumes of FMH were accurate. These values were not proper using the 1st method (CV about 30% to 64%).
Conclusions. K-B test can be the sensitive method for quantification of FMH if we assess at least 10 000 RBCs.
Introduction
The pathogenesis of hemolytic disease of newborn (HDN) was discovered in the fourties of 20th century. HDN has usually affected RhD-(negative) women who gave birth to RHD+(positive) child. D antigen is strongly immunogenic and its distribution in Caucasian population [about 20% RhD-(negative) and 80% RhD+(positive) people] cause higher risk of HDN than any other antigen among several hundred known today. Parturition, last trimester and different irregularities of pregnancy and parturition can lead to increased feto-maternal leakage, especially that blood vessels of mother and child are very close to each other in placenta. If red blood cells carrying foreign antigens on their surfaces enter the women’s circulation, her immunologic system may start producing IgG antibodies, which can pass through the placenta and destroy blood cells of foetus in subsequent pregnancy.
To provide effective prophylaxis of HDN all RhD-(negative) women, who gave birth to RhD+(positive) child should receive anti-RhD IgG immunoglobulin which neutralizes foetal cells and reduces the risk of sensitization. This prophylaxis was applied in the sixties, in Poland at the beginning of the seventies. However standard dose of anti-RhD IgG still has not been established and in different countries various standard dose are suggested in pregnancy and after complicated or non-complicated delivery. Also, there are several approaches to the evaluation of the size of FMH.
The first method of quantification of FMH was described in the fifties and is called the Kleihauer-Betke (K-B) test. In Poland this method is not in routine use, only one laboratory rarely perform it in the suspicion of large FMH. The procedure of the test is placed in Polish guidelines for blood banks.
Because we undertake investigation for quantification of FMH using different methods like microscopic, serological and flow cytometric, the aim of our study was to evaluate two ways of examination of stained films in K-B test: first way recommended by Polish and American procedures and second ordered by UK guidelines.
Material and methods
Blood Samples
Adult donor’s blood collected into EDTA was mixed with umbilical cord blood: blood count was done for each sample and then the dilution of foetal cells among adult cells was made to get artificial dilutions: 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2%. For each dilution 4-5 solutions were performed and then 10 K-B tests were carried out.
The principle of the test
K-B test is used to measure foetal cells with haemoglobin F (HbF) among adult’s cells with hemoglobin A (HbA). HbF is resistant for alkali denaturation and acid elution while HbA is removed from cells. After staining, adult cells without haemoglobin are seen as “ghost” cells, while foetal cells appear as rose-pink in color.
Performance of the test
Tests were performed using reagents ready for use (Fetal Red Cell Kit, Guest Medical UK) with the following procedure: 1) 150 μl of whole blood from the sample was mixed with the same amount of phosphate buffered saline; 2) blood smears (two for every examination) were prepared on glass slides and air-dried for 20 minutes in room temperature; 3) slides were fixed in ethanol (Fixing Reagent) for 2 minutes; 4) after being rinsed with tap water, slides were flooded with Eluting Reagent for 30 seconds and rinsed again; 5) slides were counterstained with erytrosin (Counterstain) for 3 minutes; 6) each slide was microscopically examined (10x eyepiece, 40x objective) using two methods of counting:
Method 1:
Foetal and adult cells were counted on two slides (1000 cells on each slide) and then the percentage of foetal cells was determined. From any foetal cell or one per 1000 (0,1%) to 20 (2%) was detected.
Method 2:
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Fabijańska-Mitek J: Przeciek płodowo-matczyny: skutki kliniczne i metody oceny. Acta Haematol Pol 2011; 42: 445-451.
2. Roback JD, Combs MR, Grossman BJ, Hillyer ChD (ed.): Hemolytic disease of the fetus and newborn. [In:] Technical Manual. 16th edition. Bethesda, AABB 2008; p. 935-939.
3. Butch SH: Hemolytic disease of the fetus and newborn. [In:] Immunohematology. Principles and practice. 3rd edition. Quinley ED (ed.). Baltimore, Lippincott Williams and Wilkins 2011; p. 283-296.
4. Gieleżyńska A, Fabijańska-Mitek J: Płodowo-matczyny przeciek krwi – wykrywanie i ocena ilościowa. Pol Merk Lek 2011; 177: 219-223.
5. Guidelines for the estimation of fetomaternal haemorrhage. Working Party of the British Committee for Standards in Haematology. Transfusion Taskforce 2009.
6. Łętowska M (red.): Medyczne zasady pobierania krwi, oddzielania składników i wydawania, obowiązujące w jednostkach organizacyjnych publicznej służby krwi. Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa 2011.
7. Duguid JKM, Bromilow IM, Eggington J et al.: Kleihauer testing and flow cytometry. A comparative study for assessment of feto-maternal haemorrhage. Hematology 1996; 1: 79-83.
8. Duguid JKM, Bromilow IM: Laboratory measurement of fetomaternal hemorrhage and its clinical relevance. Transfus Med Rev 1999; 13: 43-48.
9. Howarth DJ, Robinson FM, Williams M et al.: A modified Kleihauer technique for the quantification of foetomaternal haemorrhage. Transfus Med 2002: 12: 373-378.
10. Kush ML, Muench MV, Harman ChR et al.: Persistent fetal hemoglobin in maternal circulation complicating the diagnosis of fetomaternal hemorrhage. Obstet Gynecol 2005; 105: 872-874.
11. Savithrisowmya S, Singh M, Kriplani A et al.: Assessment of fetomaternal hemorrhage by flow cytometry and Kleihauer-Betke test in Rh-negative pregnancies. Gynecol Obstet Inves 2008; 65: 84-88.
12. Badzio T: Analityczne podstawy diagnostyki laboratoryjnej. Biochemia kliniczna i analityka. Angielski S. red. Warszawa, PZWL 1990; 408-448.
13. Banczak K, Zborowska H (red.): Walidacja metod pomiarowych. Higiena i bezpieczeństwo pracy w laboratorium. Wydawnictwo Werlang Dashofer, Warszawa 2009.
