© Borgis - Nowa Stomatologia 4/2012, s. 165-169
*Marta Jaworska-Zaremba1, Elżbieta Mierzwińska-Nastalska1, Ewa Swoboda-Kopeć2
Ocena wrażliwości grzybów drożdżopodobnych izolowanych z jamy ustnej użytkowników uzupełnień protetycznych, na naturalny preparat – olejek z drzewa herbacianego
Laboratory evaluation of fungi sensitivity, isolated in denture stomatitis, to natural agent – tea tree oil
1Katedra Protetyki Stomatologicznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik Katedry: prof. dr hab. n. med. Elżbieta Mierzwińska-Nastalska
2Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik Katedry: prof. dr hab. n. med. Grażyna Młynarczyk
Summary
During pact several dozen years the growth of prevalence of fungal infections in people, characterised by severe clinical course, has been observed. The problem of growth of the number, intensity and recurrent character of fungal infections is also related to patients who use prosthetic restorations, in particularly in people with decreased immunity, in course of systemic diseases. Due to largue number of failures in treatment of Candida-associated denture stomatitis and also their recurrent character it is crucial to search the new, effective antifungals. The aim of this work was estimation of in vitro susceptibility of yeast-like fungal strains, obtained from direct mucosa swabs taken from oral cavities of patients using prosthetic restorations, to the tea tree oil – natural preparation having antifungal effect. The research covered a group of 93 patients. Clinical symptoms of denture stomatitis were diagnosed in them. Mycological tests were performed with the method of direct swab taken from oral mucosa, which resulted 99 yeast-like fungal strains obtained from the cultures. Activity of the tea tree oil was analysed in the antifungal susceptibility tests in relation to cultured and model strains. On the basis of performed laboratory mycological tests, the growth of yeast-like fungi was diagnosed at 79 (84.95%) among 93 patients, from who oral mucosa swabs samples were collected. In own tests, laboratory estimation of effectiveness of natural antifungals in relation to yeast-like fungi showed varied susceptibility of 99 strains to tested preparations. Among all examinated tests, the tea tree oil characterised with lower effectiveness. Due to lower activity of tea tree oil in relation to yeast-like fungi, seems to not be proper to consider possibility of using them in Candida-associated denture stomatitis.
Wstęp
Zakażenia grzybicze błony śluzowej jamy ustnej są częstym schorzeniem wśród pacjentów użytkujących uzupełnienia protetyczne (1, 2). Infekcje te stanowią problem zdrowotny, ponieważ zakażenie drożdżakami towarzyszy 60-100% przypadków stomatopatii protetycznych (3). Szczególną rolę przypisuje się grzybom drożdżopodobnym, głównie z rodzaju Candida. Spośród wielu gatunków rodzaju Candida największe znaczenie w etiopatogenezie stomatopatii protetycznych powikłanych infekcją grzybiczą mają szczepy C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, rzadziej C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii (4, 5). Rozwój zakażenia grzybiczego zależy od wielu czynników, miejscowych i ogólnoustrojowych, w tym stanu immunologicznego gospodarza oraz stopnia patogenności szczepu. Zmniejszone wydzielanie śliny, radioterapia w obrębie głowy i szyi, leczenie immunosupresyjne, przewlekła antybiotykoterapia, niedobory żywieniowe, a także obecność węglowodanów w diecie, przy jednoczesnym użytkowaniu uzupełnień protetycznych mogą bezpośrednio przyczynić się do rozwoju stomatopatii protetycznych powikłanych infekcją grzybiczą (6). Obecność protez w jamie ustnej, zwłaszcza osiadających o rozległej płycie, poprzez ich traumatogenne oddziaływanie na błonę śluzową, a także porowatość tworzywa akrylowego, z którego wykonywane są protezy, mogą być przyczyną stanów zapalnych błony śluzowej jamy ustnej i infekcji grzybiczej.
Leczenie stomatopatii obejmuje procedury protetyczne, chirurgiczne i farmakologiczne. W terapii farmakologicznej najczęściej stosowanymi preparatami są antymikotyki z grupy polienów (nystatyna, natamycyna), azoli (klotrimazol, mikonazol, ketokonazol, flukonazol) i pochodne pirymidyny (5-fluorocytozyna). Zaleca się je w postaci miejscowo działających roztworów, maści, kremów i proszków (7).
Dużym problemem w ostatnich latach staje się narastająca oporność grzybów na powszechnie stosowane leki przeciwgrzybicze. Nie bez znaczenia jest również zwiększona zdolność biofilmu do obrony patogenów przed mechanizmami odpornościowymi gospodarza, a także fenotyp niektórych gatunków Candida (multi-drug resistant phenotype) (8). Leczenie immunosupresyjne, antybiotykoterapia, długotrwałe podawanie leków przeciwgrzybiczych mają duży wpływ na selekcję szczepów opornych i nawrotowy charakter zakażeń. Zwiększona dostępność leków, niejednokrotnie ich nadużywanie, powodują wzrost liczby szczepów opornych wśród różnych gatunków grzybów (9).
Trudności w leczeniu stomatopatii protetycznych powikłanych infekcją grzybiczą, częste reinfekcje oraz wzrastająca oporność grzybów na poszczególne antymikotyki, a także ich toksyczność, działania uboczne czy też wysokie koszty leczenia skłaniają do poszukiwania nowych leków, w tym preparatów naturalnych o działaniu przeciwgrzybiczym.
Cel pracy
Celem pracy była laboratoryjna ocena wrażliwości in vitro szczepów grzybów drożdżopodobnych, uzyskanych z wymazów bezpośrednich z błony śluzowej jamy ustnej podłoża protetycznego pacjentów użytkujących uzupełnienia protetyczne, na olejek z drzewa herbacianego (Avicenna), będący naturalnym preparatem o działaniu przeciwgrzybiczym.
Materiał i metody
Badaniami objęto grupę 93 pacjentów Katedry Protetyki Stomatologicznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, użytkujących ruchome uzupełnienia protetyczne, u których stwierdzono w badaniu klinicznym objawy stomatopatii protetycznej. Pacjentów poddano badaniom mikologicznym metodą wymazu bezpośredniego z powierzchni błony śluzowej jamy ustnej. Następnie, w Pracowni Mikologicznej dokonano posiewu na stałe podłoże Sabourauda z dodatkiem gentamycyny i chloramfenikolu (Oxoid). Płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 48 h. Obecność wzrostu kolonii grzybów oceniano po 24 i 48 h. Do dalszych badań laboratoryjnych uzyskano z hodowli 99 szczepów grzybów drożdżopodobnych. Dokonano analizy cech morfologicznych wyizolowanych szczepów, jednocześnie przeprowadzając ich identyfikację przy użyciu podłoża Chromagar Candida (BioRad) i automatycznego testu ID32 C (BioMérieux).
Na każdym etapie badania lekowrażliwości do zaszczepienia podłoży przygotowywano zawiesiny komórek grzybów w 0,85% NaCl o gęstości 1 wg skali Mc Farlanda. Określono wrażliwość wyhodowanych szczepów, a także szczepów wzorcowych C. albicans ATCC 14053, C. tropicalis ATCC 13803 i C. glabrata ATCC 90030 w stosunku do preparatu pochodzenia naturalnego, jakim jest olejek z drzewa herbacianego (Avicenna). Oceny lekowrażliwości szczepów na preparat dokonano metodą wielokrotnych rozcieńczeń preparatu w podłożu stałym RPMI 1640 plus MOPS z dodatkiem 2% glukozy i 1,5% Bacto agaru (Plate Dilution Method).
W pierwszym etapie badania lekowrażliwości grzybów drożdżopodobnych wykonano próbę pilotażową w celu określenia przedziału stężeń dla badanych preparatów, przy których następuje zahamowanie wzrostu szczepów. Do próby wybrano losowo 25 izolatów, a także przygotowano 8 różnych stężeń badanego preparatu w przedziale 100- 6000 mg na litr pożywki (mg/l) dla olejku z drzewa herbacianego. Stosując metodę badawczą opisaną poniżej dla wszystkich badanych 99 szczepów, obliczono, że ponad 95% spośród wybranych 25 izolatów poddanych badaniu pilotażowemu jest hamowana przez olejek z drzewa herbacianego w następujących stężeniach: 125; 250; 500; 1000; 2000; 4000 mg/l. Określone w próbie pilotażowej stężenia preparatu zastosowano w dalszej części badania.
Bezpośrednio przed doświadczeniem preparat rozcieńczano, zgodnie z zaleceniami producenta, w alkoholu etylowym. Do przygotowanych podłoży wprowadzano wcześniej rozcieńczony badany preparat, uzyskując stężenia określone w próbie pilotażowej. Tak przygotowane podłoża z olejkiem z drzewa herbacianego rozlewano do płytek Petriego, po 20 ml w każdej. Następnie, przygotowane wcześniej zawiesiny kolejnych 20 szczepów o gęstości 1 w skali Mc Farlanda nanoszono po zastygnięciu podłóż. Płytki inkubowano w temperaturze 37oC przez 48 h, a następnie odczytywano minimalne stężenie hamujące (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) wzrost drożdżaków po 24 h. Minimalne stężenie hamujące zostało zdefiniowane jako najniższe stężenie preparatu, przy którym następuje zahamowanie wzrostu szczepów grzybów drożdżopodobnych. W następnej kolejności dokonano analizy aktywności preparatu, obliczając MIC50 oraz MIC90 dla badanych gatunków grzybów drożdżopodobnych, dla których liczba szczepów w badaniu była ≥ 2 oraz określono zakres stężeń hamujących (MIC range). Dla szczepów w liczbie < 2 MIC50 równał się MIC90. Jako MIC50 przyjęto takie stężenie danego preparatu, przy którym zostaje zahamowany wzrost 50% badanych szczepów. Analogicznie, jako MIC90 uznano takie stężenie preparatu, przy którym zostaje zahamowany wzrost 90% badanych szczepów.
W badaniu lekowrażliwości szczepów grzybów drożdżopodobnych oraz szczepów wzorcowych zastosowano dwa układy kontrolne. Pierwszy stanowiły płytki z podłożem RPMI 1640 plus MOPS z dodatkiem 2% glukozy i 1,5% Bacto agaru niezawierające badanych preparatów, drugi płytki z podłożami zawierającymi stosowane w badaniu rozpuszczalniki: jałową wodę destylowaną i alkohol etylowy w stężeniu niehamującym wzrostu grzybów.
Wyniki i omówienie
Z wymazów bezpośrednich pobranych z powierzchni błony śluzowej jamy ustnej 93 pacjentów uzyskano w hodowli od 84,95% osób wzrost 99 szczepów grzybów drożdżopodobnych, przy czym w największym odsetku występowały gatunki Candida albicans, Candida tropicalis i Candida glabrata, odpowiednio: 57,58, 18,18 i 14,14% (ryc. 1).
Ryc. 1. Podział wyhodowanych i zidentyfikowanych 99 szczepów grzybów drożdżopodobnych (%).
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Spiechowicz E, Mierzwińska-Nastalska E: Grzybice jamy ustnej. Med Tour Press Int, Warszawa 1998. 2. Shulman JD, Rivera-Hidalgo F, Beach MM: Risk factors associated with denture stomatitis in the United States. J Oral Pathol Med 2005; 34, 340-346. 3. Vanden Abbeele A, De Meel H, Ahariz M et al.: Denture contamination by yeasts in the elderly. Gerodontology 2008; 26, 14-21. 4. Grimoud AM, Marty N, Bocquet H et al.: Colonization of the oral cavity by Candida species: risk factors in long-term geriatric care. J Oral Sci 2003; 45, 51-55. 5. Kurnatowska J, Kurnatowski P: Niektóre postacie grzybic jamy ustnej. Mikol Lek 2008; 15, 29-32. 6. Szymankiewicz M, Kowalewski J: Zakażenia wywoływane przez grzyby Candida. Czynniki predysponujące. Mikol Lek 2005; 12, 3, 189-192. 7. Mierzwińska-Nastalska E: Leczenie infekcji grzybiczej błony śluzowej jamy ustnej u użytkowników uzupełnień protetycznych. Czas Stomatol 1999; LII, 10, 685-691. 8. Ramage G, Bachman S, Patterson TF et al.: Investigation of multidrug efflux pumps in relations to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. J Antimicrobial Chemother 2002; 49, 973-980. 9. Ciok-Pater E, Białucha A: Mechanizmy oporności drożdży na stosowane leki przeciwgrzybicze. Mikol Lek 2008; 15, 49-53. 10. Sharamon S, Baginski BJ: Lecznicza siła ekstraktu grejpfruta. Oficyna Wydawnicza MH, Warszawa 1998. 11. Łukaszuk C, Krajewska-Kułak E, Niczyporuk W et al.: Pięcioletnia obserwacja lekowrażliwości szczepów grzybów drożdżopodobnych u pacjentów onkologicznych. Mikol Lek 2000; 7, 209-215. 12. Kontoyiannis DP, Lewis RE: Antifungal drug resistance of pathogenic fungi. Lancet 2002; 359, 1135-1144. 13. Glinkowska G, Strzelecka H, Skopińska E: Immunotropowe działanie roślin leczniczych. Post Nauk Med 1994; 7, 88-94. 14. Sokolnicka J, Glinkowska G, Strzelecka H: Immunostimulatory effects water-soluble exstracts of poplar buds and leaves and their polyphenolic compounds. Int J Immunother 1994; 2, 83-88. 15. Wagner H: Pflanzliche Immunostimulanzien. Zur Prophylaxe und Therapie von Erkaltungskrankheiten. Zeit fur Phytotherapie 1996; 17, 79-95. 16. Skopińska-Różewska E, Siwicki A (red.): Rola immunomodulatorów pochodzenia naturalnego w zapobieganiu i leczeniu chorób. Wydawnictwo Medyk, Warszawa 2003. 17. A’Auria FD, Laino L, Strippoli V et al.: In vitro activity of tea tree oil against Candida albicans mycelial conversion and other pathogenic fungi. J Chemother 2001; 13, 377-383. 18. Alkiewicz J, Han S, Kędzia B et al.: Zastosowanie składu inhalacyjnego opartego na olejku z drzewa herbacianego (Tea Tree Oil) w leczeniu przewlekłych, infekcyjnych nieżytów górnych dróg oddechowych. Przew Lek 2003; 6, 5, 146-153. 19. Skopińska-Różewska E, Różycka B, Białas-Chromiec B et al.: Immunostymulujące działanie olejków eterycznych. Prot Stom 1999; 1, 15-18.
