© Borgis - Postępy Fitoterapii 2/2013, s. 76-84
*Robert Kubina, Agata Kabała-Dzik, Beata Bielec, Katarzyna Smolarz, Barbara Stawiarska-Pięta, Ewa Szaflarska-Stojko
Ocena właściwości cytotoksycznych etanolowego ekstraktu z propolisu w stosunku do komórek raka okrężnicy HCT 116
Evaluation of cytotoxic activity of ethanol extract of propolis in human colon cancer cell line HCT 116
Katedra i Zakład Patologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Katowice
Kierownik Katedry i Zakładu: dr hab. n. med. Barbara Stawiarska-Pięta
Summary
Numerous researches showed that propolis exhibits many healing properties. Not only has it antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant, immunoprotective and hepatoprotective activities, but also anti-proliferative and cytotoxicity ones. The aim of this study was to evaluate total polyphenolic content and in vitro cytotoxic activity of ethanol extract of propolis depending on geographic location from where the propolis was derived and EEP concentrations used on HCT 116 colon cancer cells in in vitro tests.
Propolis samples were collected from different geographical locations in Poland. Propolis was characterized by polyphenolic content and flavonoids. A solution of ethanol extract of propolis in dimethyl sulfoxide was used as a material for the research. Ethanol from the extraction of propolis was removed by vaporization under vacuum. Cytotoxicity was evaluated by means of the MTT and LDH assays.
The cytotoxic effect of EEP at concentrations of 3.125-100 μg/ml after a 24-h incubation was from 1.11 % to 22.96% cell death. When EEP at concentration of 100 μg/ml was used, cytotoxicity amounted to 22.96%; 19.31% and 14.84% respectively for propolis from Kamianna, Łomża Landscape Park and Korbielów.
The results showed that in the case of the extract of propolis could inhibit cell growth of HCT 116 cell line. Ethanol extract of propolis from Poland obtained in the study exhibits cytotoxicity activity in colorectal carcinoma cells in vitro. MTT assay demonstrated that anti-proliferative properties of ethanol extract of propolis are dependent on the applied concentration and geographical locations.
Wstęp
Rosnące zainteresowanie niekonwencjonalnymi metodami leczenia wykorzystywanymi przez wieki sprawia, że propolis staje się coraz bardziej popularnym preparatem, stosowanym zarówno w leczeniu schorzeń miejscowych, jak i chorób wewnętrznych, których leczenie tradycyjną farmakoterapią wydaje się być nieskuteczne. Bogactwo składu substancji biologicznie czynnych w produktach pszczelich spowodowało, że znalazły one zastosowanie w wielu specjalnościach medycyny, gdzie stosowanie ich przynosi wymierne korzyści. Przykładem może być leczenie ropnych zapaleń skóry, odleżyn, nadżerek, stanów zapalnych pochwy, stanów zapalnych górnych dróg oddechowych oraz owrzodzeń błony śluzowej górnego odcinka przewodu pokarmowego i wiele innych. Zastosowanie propolisu w leczeniu chorób wewnętrznych jest do dnia dzisiejszego niedoceniane. Pozytywne efekty leczenia uzyskano u osób z chorobami układu krążenia, układu oddechowego, układu pokarmowego, a także u chorych ze schorzeniami reumatycznymi.
Propolis jest jednym z najlepiej poznanych produktów pszczelich. Słowo propolis pochodzi z języka greckiego i oznacza w dosłownym tłumaczeniu “przedmurze miasta”. Propolis jest materiałem budulcowym, będącym spoiwem, służącym zarówno do przytwierdzania plastra do ścian ramek, jak też naprawy wszelkich uszkodzeń ula. Pszczoły formują z kitu pszczelego rodzaj progu, przez który przechodzi każdy mieszkaniec ula. To swoiste „przedmurze” odpowiedzialne jest za ochronę przed wprowadzeniem bakterii oraz grzybów chorobotwórczych do wnętrza ula, gdzie znalazłyby one dogodne warunki do wzrostu, prowadząc do całkowitego wymarcia rodziny pszczelej.
Propolis jest bezpostaciową, żywicowatą, lepką substancją, produkowaną przez pszczoły, stanowiącą połączenie woskowatej wydzieliny owadów z żywicą zebraną z roślin. Wykazuje on charakterystyczny cierpki, gorzki i piekący smak. Barwa propolisu jest różnorodna – od czarnej, brązowej, poprzez czerwoną, żółtą po zieloną. Skład chemiczny propolisu jest niezwykle złożony. Zawiera około 300 różnych substancji chemicznych. Polski propolis pochodzi przede wszystkim z pączków liściowych topoli czarnej (Populus nigra), a także z brzozy (Betula) oraz olchy (Alnus) (1-3).
Liczne badania naukowe wykazały, że propolis wykazuje wiele cennych, leczniczych właściwości: działa przeciwbakteryjnie, przeciwgrzybiczo (4-6), przeciwpasożytniczo (7, 8), przeciwwirusowo (9), przeciwhepatotoksycznie (10), przeciwzapalnie (11), przeciwutleniająco (12), kardioochronnie (13), miejscowo znieczulająco (14), przeciwcukrzycowo (15), przeciwmutagennie (16). Coraz częściej także w literaturze fachowej można odnaleźć informacje na temat przeciwnowotworowego działania kitu pszczelego. Istotnym działaniem propolisu z tego punktu widzenia jest jego aktywność antyproliferacyjna, cytotoksyczna oraz proapoptotyczna w stosunku do komórek nowotworowych (17-19). Prowadzone badania eksperymentalne mają na celu potwierdzenie sposobu działania przeciwnowotworowego oraz poznanie jego dokładnego mechanizmu. Dziś wiadomo, że substancjami, którym przypisuje się działanie przeciwnowotworowe, są flawonoidy (głównie apigenina, luteolina, galangina) oraz estry kwasów fenolowych (w szczególności estry kwasu kawowego oraz ferulowego). Najwyższą aktywność przeciwnowotworową wykazuje ester fenyloetylowy kwasu kawowego. Jego mechanizm nie jest do końca poznany, wiadomo jednak, że zapobiega on wbudowywaniu tymidyny do łańcucha DNA komórek nowotworowych, przez co uniemożliwia on ich proliferację. W licznych badaniach in vitro propolis oraz jego poszczególne składniki biologicznie czynne wykazywały aktywność cytotoksyczną w stosunku do różnych typów komórek nowotworowych, takich jak komórki raka krtani, płuc, trzustki, tarczycy, jelita grubego, sutka, prostaty, a także w stosunku do komórek glejaka złośliwego.
Bufalo i wsp. (20) w badaniach in vitro opisali efekt cytotoksyczny zielonego brazylijskiego propolisu w stosunku do komórek raka krtani HEp-2. Wykazali oni, że jedynie niskie stężenia etanolowego ekstraktu propolisu wywoływały długoterminowy, stały efekt cytotoksyczny. Natomiast wyższe stężenia EEP, dodawane do komórek nowotworowych, działały krótkotrwale. Ponadto zauważyli oni, że aktywność ta jest wynikiem synergizmu substancji chemicznych zawartych w propolisie.
Badania Lee i wsp. (21) wykazały, że ester fenyloetylowy kwasu kawowego (CAPE, ang. caffeic acid phenethyl ester) działa cytotoksycznie w stosunku do linii komórkowej szczurzego glejaka C6. W badaniach tych oreślono bardzo szczegółowy mechanizm działania CAPE. Stwierdzono, że powoduje on uwolnienie cytochromu c z mitochondrium do cytozolu oraz aktywację kaspazy-3, jak również aktywację białek proapoptotycznych z rodziny Bcl-2. Jednoznacznie potwierdzono aktywację mechanizmów biochemicznych prowadzących do kontrolowanej śmierci komórek – apoptozy, w wyniku zastosowania CAPE w stosunku do komórek badanej linii.
Cel pracy
Celem prezentowanej pracy była ocena właściwości cytotoksycznych propolisu w zależności od miejsca pozyskania, jak również użytych stężeń EEP w stosunku do komórek raka okrężnicy HCT 116 w badaniach in vitro.
Materiał i metody
Materiał do badań
Materiał do badań stanowiły próbki propolisu pozyskane od pszczół z pasiek zlokalizowanych w:
– Kamiannej, w powiecie nowosądeckim (P1),
– Łomżyńskim Parku Krajobrazowym Doliny Narwi (P2),
– Korbielowie w powiecie żywieckim (P3).
Aktywność przeciwnowotworową etanolowego ekstraktu propolisu (EEP, ang. ethanol extract of propolis) oceniono przy użyciu linii komórkowej raka jelita grubego (okrężnicy) HCT 116 pochodzącej z kolekcji ATCC.
Otrzymywanie etanolowego ekstraktu z propolisu
Próbki propolisu poddano ekstrakcji etanolem. Po mechanicznym rozdrobnieniu 10 g surowego kitu pszczelego dodawano do kolb okrągłodennych zawierających 100 g 75% etanolu. Szczelnie zamknięte kolby umieszczono na wytrząsarce na okres dwóch tygodni w temperaturze pokojowej, bez dostępu światła. Po tym czasie ekstrakty chłodzono w temp. 4°C przez 24 godz. w celu usunięcia wszystkich substancji nierozpuszczalnych w etanolu. W kolejnym etapie ekstrakty sączono pod zmniejszonym ciśnieniem przy użyciu sączka filtracyjnego standardowego nr 4 (Whatman Grade No. 4 Filter Paper). Uzyskany filtrat odparowano za pomocą wyparki próżniowej w temperaturze 40°C. W ten sposób w kolbach okrągłodennych (o znanej masie) otrzymano ciągliwą substancję koloru brązowego, która zawierała nieznaczne ilości rozpuszczalników – etanolu i wody. W następnym etapie umieszczono otrzymane ekstrakty w cieplarce na okres 7 dni w celu odparowania pozostałości rozpuszczalników. Po tym czasie otrzymano suchą masę koloru ciemnobrązowego, która posłużyła do sporządzenia roztworów roboczych. W tym celu EEP rozpuszczono w dimetylosulfotlenku, otrzymując roztwór EEP o stężeniu 51,2 mg/ml (EEPDMSO).
Analiza składu polifenoli oraz flawonoidów w badanych próbkach EEP
Całkowitą zawartość polifenoli w próbkach propolisu określono stosując metodę kolorymetryczną z odczynnikiem fenolowym Folin-Ciocalteu. Mieszaninę referencyjną stanowiła pinocembryna oraz galangina w stosunku wagowym 2:1, przygotowana metodą seryjnych rozcieńczeń (od 0,021 do 0,335 mg/ml). Posłużyła ona do wykonania krzywej kalibracyjnej. 1 ml roztworu badanego przeniesiono do kolby miarowej o pojemności 50 ml, zawierającej 15 ml wody destylowanej. Następnie dodano 4 ml odczynnika Folin-Ciocalteu i 6 ml 20% roztworu węglanu sodu. Całość doprowadzono wodą destylowaną do objętości 50 ml. Absorbancję mierzono po 2 godz. przy długości fali λ=760 nm.
Całkowitą zawartość flawonoidów określano przez kwantyfikację flawonów/flawonoli i flawanonów/dihydroflawonoli. Roztwory standardowe galanginy (0,04 mg/ml) dla flawonów /flawonoli i pinocembryny (1 mg/ml) dla flawanonów/dihydroflawonoli zostały przygotowane w celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej. Przygotowano serię pięciu rozcieńczeń galanginy w stężeniach od 0,005 do 0,04 mg/ml oraz pinocembryny w stężeniach od 0,1 do 0,8 mg/ml.
Próbkę 1 ml badanego roztworu i 0,5 ml 5% metanolowego roztworu chlorku glinu (AICI3) zmieszano w kolbie zawierającej 10 ml metanolu. Objętość doprowadzono do 25 ml poprzez uzupełnienie metanolem i po 30 min mierzono absorbancję przy długości fali λ=425 nm względem ślepej próby, w celu ilościowego oznaczenia flawonów/flawonoli.
Próbkę EEPDMSO (1 ml) oraz 2 ml roztworu 2,4-dinitrofenylohydrazyny (1 g DNP), zmieszanego z 2 ml 96% kwasu siarkowego (VI) i rozcieńczonego do 100 ml metanolem, ogrzewano w temperaturze 50°C przez 50 min. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, roztwór rozcieńczono do 10 ml 10% metanolowym roztworem wodorotlenku potasu. Tak uzyskany roztwór w ilości 0,5 ml przeniesiono do kolby miarowej i rozcieńczono ponownie metanolem do objętości 25 ml. W celu oszacowania stosunku flawanonów/dihydroflawonoli, absorbancję mierzono przy długości fali λ=486 nm wobec ślepej próby
Próby ślepe przygotowano podobnie, zastępując EEPDMSO równoważną ilością etanolu i przeprowadzono przez wszystkie kroki zastosowanej wyżej procedury. Uzyskane wyniki przedstawiono jako średnią zawartość procentową i odchylenie standardowe (SD). Zawartość innych związków polifenolowych oceniano poprzez odjęcie całkowitej zawartości flawonoidów od całkowitej zawartości polifenoli.
Całkowitą zawartość flawonoidów uzyskano przez zsumowanie zawartości flawonów/flawonoli i flawanonów/dihydroflawonoli w badanych próbkach propolisu (22, 23).
Hodowla komórkowa
Doświadczenie wykonano na komórkach raka jelita grubego HCT 116. Linia komórkowa pochodziła z kolekcji ATCC i hodowana była zgodnie z zaleceniami producenta przy użyciu zmodyfikowanego podłoża McCoy‘s z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej. Komórki hodowane były w butelkach o powierzchni 25 cm2 (PAA) w zmodyfikowanym podłożu McCoy’s z dodatkiem następujących antybiotyków 100 IU/ml penicyliny, 100 μl/ml streptomycyny oraz 0,25 μl/ml amfoterycyny B. Komórki hodowano w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze nasyconej parą wodną z 5% dodatkiem CO2.
Po uzyskaniu przez komórki 80% konfluencji, obserwowanej w mikroskopie w układzie odwróconym, dokonywano pasażowania komórek.
Ocena cytotoksyczności testem MTT
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Produkty pszczół w medycy-nie. Wyd. Apis, Lublin 2007. 2. Kędzia B. Pochodzenie propolisu w świetle teorii i badań naukowych. Herba Pol 2008; 54(4):179-86. 3. Tichonov IR, Jarnych TG, Czernych WP i wsp. Teoria i praktyka wytwarzania leczniczych preparatów propolisowych. Wyd. Apipol Farma, Myślenice 2007. 4. Velazquez C, Navarro M, Acosta A i wsp. Antibacterial and free-radical scavenging activities of Sonoran propolis. J Appl Microbiol 2007; 103:1747-56. 5. Wojtyczka RD, Kubina R, Kabała D i wsp. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa etanolowego ekstraktu propolisu. Ann Acad Med Siles 2012; 66(2):39-48. 6. Kabała-Dzik A, Szaflarska-Stojko E, Wojtyczka RD. Comparative studies on the antimicrobial activity of propolis balm and silver sulphadiazine applied to burn wounds in pigs. Bull Vet Inst Pulawy 2003; 47:541-5. 7. Nilforoushzadeh MA, Shirani-Bidabadi L, Zolfaghari-Baghbaderani A i wsp. Comparison of Thymus vulgaris (Thyme), Achillea millefolium (Yarrow) and propolis hydroalcoholic extracts versus systemic glucan time in the treatment of cutaneous leishmaniasis in balb/c mice. J Vector Borne Dis 2008; 45(4):301-6. 8. Pontin K, Da Silva-Filho AA, Santos FF i wsp. In vitro and in vivo antileishmanial activities of a Brazilian green propolis extract. Parasitol Res 2008; 103(3):487-492. 9. Huleihel M, Isanu V. Anti-herpes simplex virus effect of an aqueosa extract of propolis. Isr Med Assoc J 2002; 4:923-7. 10. Basnet P, Matusushige K, Hase K i wsp. Potent antihepatotoxic activity of dicaffeoyl quinic acids from propolis. Biol Pharm Bull 1996; 19(4):655-7. 11. Viuda-Martos M, Ruiz-Navajas Y, Fernandez-Lopez J i wsp. Functional properties of honey, propolis and royal jelly. J Food Sci 2008; 73(9):117-24. 12. da Silva-Frozza CO, Garcia CS, Gambato G i wsp. Chemical characterization, antioxidant and cytotoxic activities of Brazilian red propolis. Food Chem Toxicol 2012; 52C:137-142. 13. Alyane M, Kebsa LB, Boussenane H i wsp. Cardioprotective effects and mechanism of action of polyphenols extracted from propolis against doxorubicin toxicity. Pak J Pharm Sci 2008; 21(3):201-9. 14. Bricević H, Kostić A, Gaon ID. The examination of propolis as a potential local anesthetic. Stomatol Vjesn 1981; 10(3-4):125-8. 15. Kang LJ, Lee HB, Bae HJ i wsp. Antidiabetic effect of propolis: reduction of expression of glucose-6-phosphatase through inhibition of Y279 and Y216 autophosphorylation of GSK-3α/β in HepG2 cells. Phytother Res 2010; 24(10):1554-61. 16. Tavares DC, Mazzaron-Barcelos GR, Silva LF i wsp. Propolis-induced genotoxicity and antigenotoxicity in Chinese hamster ovary cells. Toxicol In Vitro 2006; 20(7):1154-8. 17. Teerasripreecha D, Phuwapraisirisan P, Puthong S i wsp. In vitro antiproliferative/cytotoxic activity on cancer cell lines of a cardanol and a cardol enriched from Thai Apis mellifera propolis. BMC Complement Altern Med 2012; 12:27. 18. Li F, Awale S, Tezuka Y i wsp. Cytotoxicity of constituents from Mexican propolis against a panel of six different cancer cell lines. Nat Prod Commun 2010; 5(10):1601-6. 19. Kubina R, Kabała-Dzik A, Bułdak R i wsp. Ocena właściwości proapoptotycznych etanolowego ekstraktu propolisu w badaniach in vitro. Post Fitoter 2011; 4:232-7. 20. Búfalo MC, Candeias JM, Sforcin JM. In vitro cytotoxic effect of Brazilian green propolis on human laryngeal epidermoid carcinoma (HEp-2) cells. Evid Based Complement Alternat Med 2009; 6(4):483-7. 21. Lee YJ, Kuo HC, Chu CY i wsp. Involvement of tumor suppressor protein p53 and p38 MAPK in caffeic acid phenethyl ester induced apoptosis of C6 glioma cells. Biochem Pharmacol 2003; 15(66):2281-9. 22. Chang CC, Yang MH, Wen i wsp. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. J Food Drug Anal 2002; 10:178-82. 23. Popova M, Bankova VS, Butovska D i wsp. Validated methods for the quantification of biologically active constituents of poplar type propolis. Phytochem Anal 2004; 15:235-40. 24. Bankova V. Propolis standard: update, International Honey Commission Group Standards for bee products other than honey, Tzarevo 2008. 25. Bankova V. Chemical diversity of propolis and the problem of standardization. J Ethnopharmacol 2005; 100(1-2):114-7. 26. Szliszka E, Zydowicz G, Mizgala E i wsp. Artepillin C (3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid) sensitizes LNCaP prostate cancer cells to TRAIL-induced apoptosis. Int J Oncol 2012; 41(3):818-28. 27. Jin UH, Song KH, Motomura M i wsp. Caffeic acid phenethyl ester induces mitochondria-mediated apoptosis in human myeloid leukemia U937 cells. Mol Cell Biochem 2008; 310(1-2):43-8. 28. Chen CN, Wu CL, Lin JK. Apoptosis of human melanoma cells induced by the novel compounds propolin A and propolin B from Taiwenese propolis. Cancer Lett 2007; 245(1-2):218-31. 29. Badr MO, Edrees NM, Abdallah AA i wsp. Anti-tumour effects of Egyptian propolis on Ehrlich ascites carcinoma. Vet Ital 2011; 47(3):341-50. 30. Chen CN, Hsiao CJ, Lee SS i wsp. Chemical modification and anticancer effect of prenylated flavanones from Taiwanese propolis. Nat Prod Res 2012; 26(2):116-24. 31. Omene CO, Wu J, Frenkel K. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) derived from propolis, a honeybee product, inhibits growth of breast cancer stem cells. Invest New Drugs 2012; 30(4):1279-88. 32. Scifo C, Milasi A, Guarnera A i wsp. Resveratrol and propolis extract: an insight into the morphological and molecular changes inducted in DU145 cells. Oncol Res 2006; 15(9):409-21. 33. Banskota AH, Nagaoka T, Sumioka LY i wsp. Antiproliferative activity of the Netherlands propolis and its active principles in cancer cell lines. J Ethnopharmacol 2002; 80(1):67-73. 34. Barbarić M, Mišković K, Bojić M i wsp. Chemical composition of the ethanolic propolis extracts and its effect on HeLa cells. J Ethnopharmacol 2011; 135(3):772-8.
