© Borgis - Nowa Medycyna 3/2014, s. 118-124
*Aleksandra Zielińska, Małgorzata Latocha, Dariusz Kuśmierz, Elektra Sliupkas-Dyrda
Udział metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej (MMPs) w progresji czerniaka
Matrix metalloproteinases (MMPs) in melanoma progression
Zakład Biologii Komórki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Katowice
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Małgorzata Latocha
Summary
Melanoma (melanoma malignum) belongs to the group of neoplasms with extremly metastatic ability via lymphatic vessels as well as blood vessels. Many data suggest correlation between melanoma progression and proteolitic enzymes expression in cancer cells. The most important enzymes involved in melanoma progression are plasminogen actovators and matrix metalloproteinases (MMPs).
MMPs are involved in physiological as well pathological processes and are engaged in remodeling and degradation of basement membrane and compounds of extracellular matrix. In cancer cells the changes in matrix metalloproteinases expression profile and changes of MMPs genes activity as well as the enzymatic activity of the proteinas are observed. It is assumed, the correlation exist between the expression profile as well as the expression level of MMPs enzymes and the stage of melanoma and the influence on prediction.
MMPs activity is regulated by interreaction with endogenous inhibitors: TIMP-1, -2, -3 and -4. The loss of balance between MMPs expression and the expression of TIMPs (tissue inhinitors of MMPs) is the reason of the exscessive degradation of extracellular matrix compounds during tumor cells invasion. Melanoma cells may produce a number of MMPs, including: MMP-1, -2, -9, -13, -14 as well as theirs inhibitors: TIMP-1, -2, -3. Individual MMPs and TIMPs are engaged in different stages of melanoma progression. Therefore, those enzymes may be considered as potential melanoma biomarkers used in diagnosis and prediction of this cancer.
WSTĘP
Czerniak (melanoma malignum) należy do grupy niezwykle inwazyjnych nowotworów o bardzo wysokiej zdolności tworzenia przerzutów drogą naczyń limfatycznych i krwionośnych. Wyniki prowadzonych badań sugerują, że w progresji czerniaka bardzo ważną rolę odgrywają różne układy enzymów proteolitycznych, do których należy system aktywatorów plazminogenu oraz rodzina metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej (MMPs) (1).
Obecnie, zgodnie z rekomendacjami American Joint Committee on Cancer (AJCC), ocena i prognozowanie przebiegu czerniaka oparte są na analizie głębokości naciekania, obecności owrzodzeń oraz liczby przerzutów do regionalnych węzłów chłonnych (2, 3). Dodatkowe kryteria prognostyczne to indeks mitotyczny, zwiększona objętości jądra komórkowego w stosunku do cytoplazmy komórki, występowanie ognisk satelitarnych, ocena węzła wartowniczego i inwazji węzłów chłonnych (3).
Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej poprzez udział w degradacji składników macierzy pozakomórkowej, w tym błony podstawnej, zaangażowane są w proces inwazji komórek czerniaka (3). Dlatego też enzymy te mogą być rozpatrywane jako potencjalne biomarkery czerniaka, a wiedza dotycząca ich zaangażowania w poszczególne etapy rozwoju tego nowotworu może przyczynić się do opracowania nowych metod diagnostycznych oraz metod pozwalających na prognozowanie.
Charakterystyka metaloproteinaz
Metaloproteinazy (MMPs) stanowią liczną rodzinę enzymów proteolitycznych, których aktywność uzależniona jest od jonów Zn2+ i Ca2+ (4, 5). Biorą one udział w różnych procesach fizjologicznych oraz patologicznych. Zaangażowane są w procesy przebudowy i degradacji błony podstawnej oraz składników macierzy pozakomórkowej (ECM) (6). Do chwili obecnej scharakteryzowano 25 enzymów tej grupy (22 u człowieka) oraz ich 4 inhibitory (tkankowe inhibitory metaloproteinaz; TIMPs) (7, 8) (tab. 1). Ekspresja genów metaloproteinaz zachodzi niemal we wszystkich komórkach: w fibroblastach, keratynocytach, makrofagach, komórkach śródbłonka, komórkach dendrytycznych Langerhansa, neuronach, komórkach mikrogleju, miocytach, a także w komórkach nacieku zapalnego: w monocytach, limfocytach T (8). Zwiększoną aktywność metaloproteinaz obserwuje się w różnych stanach patologicznych, m.in. w rozrostach nowotworowych, zapaleniu stawów, chorobach przyzębia, miażdżycy, kardiomiopatii roztrzeniowej, zawale mięśnia sercowego i chorobach skóry (9). W przypadku nowotworów, w większości których dochodzi do podwyższenia zarówno ekspresji, jak i aktywności metaloproteinaz, często wskazuje się na możliwość istnienia zależności poziomu ekspresji tych enzymów od stopnia zaawansowania nowotworu. Wyniki wielu badań wykazują negatywny wpływ zmiany profilu ekspresji MMPs na rokowanie, chociaż opisano także przypadki, np. w raku jelita grubego, gdzie zwiększona ekspresja wybranych metaloproteinaz (MMP-9, MMP-12) w komórkach nowotworowych związana jest z dłuższym czasem przeżycia i mniejszą zdolnością do przerzutowania (10).
Tabela 1. Klasyfikacja metalopoteinaz (7, 47, 48).
| Grupa | MMPs | Nazwa alternatywna | Lokalizacja na ludzkim chromosomie | Substraty |
| Kolagenazy | MMP-1 | Kolagenaza 1 | 11q22-23 | Kolagen typu I, II, III, VII, VIII, X, XI, żelatyna, entaktyna, fibronektyna, laminina, tenascyna, vitronektyna, ?1-antychymotrypsyna, ?2-makroglobulina, fibryna, fibrynogen, pro-MMP-2, pro-MMP-9, pro-TNF-? |
| MMP-8 | Kolagenaza 2 | 11q21-22 | Kolagen typu I, II, III, agrekan, ?2-makroglobulina, fibrynogen |
| MMP-13 | Kolagenaza 3 | 11q22.3 | Kolagen typu I, II, III, IV, VI, IX, XIV, żelatyna, agrekan, fibronektyna, tenascyna, ?2-makroglobulina, kazeina, czynnik krzepnięcia XII, fibrynogen, pro-MMP-9 |
| MMP-18 | Kolagenaza 4 | – | Kolagen typu I, żelatyna |
| Żelatynazy | MMP-2 | Żelatynaza A | 16q13 | Kolagen typu I, II, III, IV, VII, IX, X, XI, żelatyna, agrekan, elastyna, entaktyna, fibronektyna, IGFBP, laminina, tenascyna, vitronektyna, fibryna, fibrynogen, pro-MMP-9, pro-MMP-13, plazminogen, pro-TNF-? |
| MMP-9 | Żelatynaza B | 20q11.2-q13.1 | Kolagen typu IV, V, XI, XIV, żelatyna, agrekan, dekoryna, elastyna, IGFBP, laminina, vitronektyna, ?2-makroglobulina, endotelina, kazeina, fibryno-gen, IL-1?, pro-MMP-2, plazminogen, pro-TNF-? |
| Stromelizyny | MMP-3 | Stromelizyna 1 | 11q23 | Kolagen typu III, IV, V, VII, IX, X, XI, żelatyna, agrekan, dekoryna, elastyna, entaktyna, fibronektyna, IGFBP, laminina, osteonektyna, perlekan, tenascyna, vitronektyna, ?1-antychymotrypsyna, ?2-makroglobulina, kazeina, E-kadheryna, fibryna, fibrynogen, IL-1?, pro-MMP-1, pro-MMP-7, pro-MMP-8, pro-MMP-9, pro-MMP-13, pro-TNF-? |
| MMP-10 | Stromelizyna 2 | 11q22.3-23 | Kolagen typu III, IV, V, żelatyna, agrekan, elastyna, fibronektyna, kazeina, fibrynogen, pro-MMP-1, pro-MMP-7, pro-MMP-8, pro-MMP-9 |
| MMP-11 | Stromelizyna 3 | 22q11.2 | IGFB, ?2-makroglobulina |
| Matrylizyny | MMP-7 | Matrylizyna 1 | 11q21-22 | Kolagen typu I, IV, żelatyna, agrekan, dekoryna, elastyna, entaktyna, fibronektyna, laminina, tenascyna, vitronektyna, kazeina, E-kadheryna, fibrynogen, pro-MMP-1, pro-MMP, pro-MMP-9, plazminogen, pro-TNF-? |
| MMP-26 | Matrylizyna 2 | 11p15 | Kolagen typu IV, żelatyna, fibrynogen, fibronektyna, vitronektyna, kazeina, pro-MMP-9 |
| Metaloproteinazy błonowe | MMP-14 | MT1-MMP | 14q11-q12 | Kolagen typu I, II, III, żelatyna, agrekan, entaktyna, fibronektyna, perlekan, vitronektyna, ?2-makroglobulina, CD44, czynnik XII, fibryna, fibrynogen, ?v-integryna, pro-MMP-2, pro-MMP-13, tenascyna, pro-TNF-? |
| MMP-15 | MT2-MMP | 15q13-q21 | Agrekan, entaktyna, fibronektyna, laminina, perlekan, tenascyna, pro-MMP-2 |
| MMP-16 | MT3-MMP | 8q21 | Kolagen typu III, żelatyna, kazeina, fibronektyna, pro-MMP-2 |
| MMP-17 | MT4-MMP | 12q24.3 | Żelatyna, fibryna, fibrynogen, pro-MMP-2, pro-TNF-? |
| MMP-24 | MT5-MMP | 20q11.2 | Żelatyna, fibronektyna, pro-MMP-2 |
| MMP-25 | MT6-MMP | 16p13.3 | Kolagen typu IV, żelatyna, fibronektyna, fibrynogen, fibryna, pro-MMP-2 |
| Inne | MMP-12 | Metaloelastaza | 11q22.2-q22.3 | Kolagen typu I, IV, żelatyna, agrekan, elastyna, entaktyna, fibronektyna, laminina, vitronektyna, czynnik XII, ?2-makroglobulina, fibrynogen, IgG, plazminogen, pro-TNF-? |
| MMP-19 | – | 12q14 | Kolagen typu I, IV, żelatyna, fibronektyna, laminina, agrekan, entaktyna, tenascyna, |
| MMP-20 | Enamelizyna | 11q22 | Kolagen typu XVIII, amelogenina, agrekan |
| MMP-21 | XMMP | 1p36 | – |
| MMP-22 | CMMP | 1p36.3 | Żelatyna |
| MMP-23 | CA-MMP | 1p36.3 | Żelatyna |
| MMP-27 | CMMP | 11q24 | – |
| MMP-28 | Epilizyna | 17q21.1 | Kazeina |
Funkcja fizjologiczna MMPs
Fizjologiczna rola metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej nadal nie jest dobrze poznana. Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej zaangażowane są w przebieg dwóch bardzo ważnych procesów biologicznych: rozwoju embrionalnego oraz morfogenezy tkanek. Prawidłowy przebieg tych procesów wymaga naruszenia ciągłości błony podstawnej w celu umożliwienia migracji komórek oraz przebudowy mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego (11, 12). Podwyższona ekspresja większości metaloproteinaz jest charakterystyczna dla procesów związanych z rozrodem (m.in.: cykl menstruacyjny, owulacja, inwolucja macicy, piersi i gruczołu krokowego) (13). Matrylizyna, stromelizyny oraz żelatynaza A są produkowane podczas najbardziej aktywnych faz cyklu estrogenowego u myszy. Podwyższony poziom produkcji tych metaloproteinaz, łącznie z kolagenazą 2 i 3, obserwowany jest podczas poporodowej inwolucji macicy u myszy (14). MMP-9 odgrywa istotną rolę w licznych procesach rozwojowych. Badania wykazały, że u myszy pozbawionych genu MMP9 dochodzi do wadliwego formowania się kości na podłożu chrzęstnym. Dochodzi tu do zahamowania apoptozy chondrocytów oraz nieprawidłowego tworzenia się naczyń krwionośnych (15). Również celowana inaktywacja genu MT1-MMP (MMP-14) u myszy prowadzi do powstania nieprawidłowości w obrębie szkieletu, tkanki łącznej oraz unaczyniania, prowadzących do przedwczesnej śmierci organizmu (16). Z kolei MMP-2 oraz MMP-3 biorą udział w regulacji szlaku morfogenezy gruczołu sutkowego w okresie dojrzewania płciowego (17). MMP-2 i MMP-9, pobudzając różnicowanie adipocytów, przyczyniają się również do rozrostu i odkładania się tkanki tłuszczowej (adipogeneza). Jednak pojawiają się doniesienia, że inne MMPs wpływają hamująco na ten proces. Zwiększoną adipogenezę podczas inwolucji gruczołu sutkowego obserwuje się u myszy pozbawionych genu MMP3 (17).
Metaloproteinazy zaangażowane są również w takich procesach jak gojenie ran oraz przebudowa tkanek, którym towarzyszy migracja keratynocytów do brzegów rany w celu wytworzenia nabłonka w obrębie uszkodzonej powierzchni. Badania przeprowadzone na kulturach komórkowych wykazały, że do migracji keratynocytów niezbędna jest aktywność proteolityczna MMP-1 (18).
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Hofmann UB, Houben R, Bröcker EB, Becker JC: Role of matrix metalloproteinases in melanoma cell invasion. Biochimie 2005; 87: 307-314. 2. Kuivanen T, Ahokas K, Virolainen S et al.: MMP-21 is upragelated at early stages of melanoma progression but disappears with more aggressive phenotype. Virchows Arch 2005; 447: 954-960. 3. Clark WH Jr, From L, Bernardino EH: Histogenesis and biologic behavior of primary human malignant melanoma of the skin. Cancer Res 1969; 29: 705-727. 4. Curran S, Murray GI: Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. Review article. Pathology 1999; 189: 300-308. 5. Dziankowska-Bartkowiak B, Waszczykowska E, Żebrowska A: Udział metaloproteinaz i ich inhibitorów w patomechanizmie wybranych chorób skóry. Alerg Astma Immun 2004; 9: 71-79. 6. Wideł MS, Wideł M: Mechanizmy przerzutowania i molekularne markery progresji nowotworów złośliwych. I. Rak jelita grubego. Post Hig Med Dośw 2006; 60: 453-470. 7. Chaussain-Miller C, Fioretti F, Goldberg M, Menashi S: The role of matrix Metalloproteinases (MMPs) in human caries. J Dent Res 2006; 85: 22-32. 8. Bogaczewicz J, Jasielski P, Mosiewicz A et al.: Rola metaloproteaz macierzy i tkankowych inhibitorów metaloproteaz w inwazji nowotworów pochodzenia neuroepitelialnego. Neurol Neurochir Pol 2006; 40: 404-412. 9. Żebrowska A, Bogdańska M, Waszczykowska E: Metaloproteinazy i adamalizyny w patomechanizmie pemfigoidu. Post Dermatol Alergol 2005; 22: 283-287. 10. Egeblad M, Werb Z: New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev 2000; 2: 161-174. 11. Brinckerhoff CE, Matrisian LM: Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nat Rev Mol Cell Biol 2002; 3: 207-214. 12. Knorr E, Schmidtberg H, Vilcinskas A, Altincicek B. MMPs Regulate both development and immunity in the tribolium model insect. PLoS One 2009; 4: 4751e. 13. Curry TE Jr, Osteen KG. The matrix metalloproteinase system: changes, regulation, and impact throughout the ovarian and uterine reproductive cycle. Endocrynology 2003; 24: 428-465. 14. Balbin M, Fueyo A, Knauper V et al.: Collagenase 2 (MMP-8) expression in murine tissue-remodeling processes. Analysis of its potential role in postpartum involution of the uterus. J Biol Chem 1998; 273: 23959-23968. 15. Vu T H, Shipley J M, Dergers G et al.: MMP-9/gelatinase B is a key regulator of growth plate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes. Cell 1998; 93: 411-422. 16. Zhou Z, Apte SS, Soininen R et al.: Impaired endochondral ossification and angiogenesis in mice deficient in membrane-type matrix metalloproteinase I. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 4052-4057. 17. Wiseman BS, Sternichy MD, Lund LR et al.: Site-specific inductive and inhibitory activities of MMP-2 and MMP-3 orchestrate mammary gland branching morphogenesis. J Cell Biol 2003; 162: 1123-1133. 18. Alexander CM, Selvarajan S, Mudgett J, Werb Z: Stromelysin-1 regulates adipogenesis during mammary gland involution. J Cell Biol 2001; 152: 693-703. 19. Pilcher BK, Dumin JA, Sudbeck BD et al.: The activity of collagenase-1 is required for keratinocyte migration on a type I collagen matrix. J Cell Biol 1997; 137: 1445-1457. 20. Folgueras AL, Pendas AM, Sanchez LM, Lopez-Otin C: Matrix metalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies. Int J Dev Biol 2004; 48: 411-424. 21. Giarnieri E, Alderisio M, Mancini R et al.: Tissue inhibitor of metalloproteinase 2 (TIMP-2) expression in adenocarcinoma pleural effusions. Oncol Rep 2008; 19: 483-487. 22. Nagase H, Visse R, Murphy G: Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovasc Res 2006; 69: 562-573. 23. Gomez D, Alonso DF, Yoshiji H, Thorgeirsson UP: Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological function. Eur J Cell Biol 1997; 74: 111-122. 24. Leco K, Khokha R, Pavloff N et al.: Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3) is an extracellular matrix-associated protein with a distinctive pattern of expression in mouse cells and tissues. J Biol Chem 1994; 269: 9352-9360. 25. Kerkelä E, Saarialho-Kere U: Matrix metalloproteinases in tumor progression: focus on basal and squamous cell skin cancer. Exp Dermatol 2003; 12: 109-125. 26. Zafarullah M, Su S, Martel-Pelletier J et al.: Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) mRNA is constitutively expressed in bovine, human normal, and osteoarthritic articular chondrocytes. J Cell Biochem 1996; 60: 211-217. 27. Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H: Tissue inhibitors of metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochim Biopys Acta 2000; 1477: 267-283. 28. Henriet P, Blavier L, DeClerck YA: Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) in invasion and proliferation. APMIS 1999; 107: 111-119. 29. Yang W, Arii S, Gorrin-Rivas MJ et al.: Human macrophage metalloelastase gene expression in colorectal carcinoma and its clinicopathologic significance. Cancer 2001; 91: 1277-1283. 30. Takeha, S, Fujiyama Y, Bamba T et al.: Stromal expression of MMP-9 and urokinase receptor is inversely associated with liver metastasis and with infiltrating growth in human colorectal cancer: a novel approach from immune/inflammatory aspect. Jpn J Cancer Res 1997; 88: 72-81. 31. Jiang, Y, Wang M, Celiker MY et al.: Stimulation of mammary tumorigenesis by systemic tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 4 gene delivery. Cancer Res 2001; 61: 2365-2370. 32. Hayakawa T, Yamashita K, Ohuchi E, Shinagawa A: Cell growth-promoting activity of tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2). J Cell Sci 1994; 107: 2373-2379. 33. Yoshiji H, Harris SR, Raso E et al.: Mammary carcinoma cells over-expressing tissue inhibitor of metalloproteinases-1 show enhanced vascular endothelial growth factor expression. Int J Cancer 1998; 75: 81-87. 34. Wang Z, Juttermann, R, Soloway PD: TIMP-2 is required for efficient activation of proMMP-2 in vivo. J Biol Chem 2000; 275: 26411-26415. 35. Durko M, Navab R, Shibata HR, Brodt P: Suppression of basement membrane type IV collagen degradation and cell invasion in human melanoma cells expressing an antisense RNA for MMP-1. Biochim Biophys Acta 1997; 1356: 271-280. 36. Hofmann UB, Eggert AAO, Blass K et al.: Expression of matrix metalloproteinase in the microenvironment of spontaneous and experimental melanoma metastases reflects the requirements for tumor formation. Cancer Res 2003; 63: 8221-8225. 37. Zucker S, Cao J: Measurement of matrix metalloproteinases in serum of patients with melanoma: snarled in technical pitfalls. Commentary on Nikkola et al., p. 5158. Clin Cancer Res 2005; 11: 5069-5070. 38. Vaisanen A, Tuominen H, Kallioienen M, Turpeenniemi-Hujanen T: Matrix metaloproteinase-2 (72kD type IV collagenase) expression occurs in the early stage of human melanocytic tumor progression and may have prognostic value. J Pathol 1996; 180: 283-289. 39. Hofmann UB, Westphal JR, Wass ET et al.: Matrix metalloproteinases in human melanoma cell lines and xenografts: increased expression of activated matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) correlates with melanoma progression. Br J Cancer 1999; 81: 774-782. 40. Kurshat P, Wickenhauser C, Groth W et al.: Identification of activated matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) as the main gelatinolytic enzyme in malignant melanoma by in situ zymography. J Pathol 2002; 197: 179-187. 41. Iida J, Wilhemson KL, Price MA et al.: Membrane type-1 matrix metalloproteinase promotes human melanoma invasion and growth. J Invest Dermatol 2004; 122: 167-176. 42. van den Oord JJ, Paemen L, Opdenakker G, De Wolf-Peeters C: Expression of gelatinase B and the extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN in benign and malignant pigment cell lesions of the skin. Short Communication. Am J Pathol 1997; 151: 665-670. 43. Nikkola J, Vihnen P, Vlaykova T et al.: High expression levels of collagenase-1 and stromelisin-1 correlate with shorter disease-free survival in human metastatic melanoma. Int J Cancer 2002; 97: 432-438. 44. Seo DW, Li H, Guedez L et al.: TIMP-2 mediated inhibition of angiogenesis: an MMP-independent mechanism. Cell 2003; 114: 171-180. 45. Morrison CJ, Butler GS, Bigg HF et al.: Cellular activation of MMP-2 (gelatinase A) by MT2-MMP occurs via a TIMP-2-independent pathway. J Biol Chem 2001; 276: 47402-47410. 46. Wandel E, Raschke A, Hildebrandt G et al.: Fibroblasts enhance the invasive capacity of melanoma cells in vitro. Arch Dermatol Res 2002; 293: 601-608. 47. Visse R, Nagase H: Matrix Metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases. Structure, function and biochemistry. Circ Res 2003; 92: 827-839. 48. Łapka A, Goździalska A, Jaśkiewicz J: Rola metaloproteinaz macierzy pozakomórkowej w nowotworach piersi, ze szczególnym uwzględnieniem roli żelatynazy A oraz żelatynazy B. Post Biol Komórki 2006; 33: 683-695.
