© Borgis - Postępy Fitoterapii 1/2016, s. 12-19
*Weronika Wojnar, Ewa Kucharek, Ilona Kaczmarczyk-Sedlak
Analiza zawartości związków farmakologicznie czynnych w zielu seradeli siewnej (Ornithopus sativus Brot.)
Analysis of pharmacologically active compounds content in herb of seradella (Ornithopus sativus Brot.)
Katedra Farmakognozji i Fitochemii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik Katedry: dr hab. n. farm. Ilona Kaczmarczyk-Sedlak
Summary
Ornithopus sativus Brot. (seradella or common bird’s foot) is an annual forage crop belonging to Fabaceae family. Other plants belonging to this family are commonly used as medicinal plants or as a source of pharmacologically active compounds such as coumarins, saponins, phenolic acids, alkaloids and flavonoids (especially isoflavonoids).
The aim of the presented study was to identify pharmacologically active compounds in the herb of common bird’s foot.
The grounded material (aerial parts of the plant) was extracted in various extrahents and then quantitative tests (for flavonoids, tannins and saponins) as well as 1D and 2D thin layer chromatography for flavonoids, phenolic acids, coumarins, trigonneline and arbutin were performed. In 1D and 2D TLC extracts were separated on Silica-gel plates 60 F254, visualized and then analyzed in UV light.
Obtained results indicated, that in analyzed herb, the tannins and flavonoids are present, while there was no sign of saponins. Among all detected substances, some flavonoids (quercetin, kaempferol, genistein, daidzein, glabridin, biochanin A, rhamnetin, luteolin, apigenin, formononetin and mirycetin), were found in seradela herb. Phenolic acids (caffeic acid, chlorogenic acid and ferulic acid) and coumarins (umbelliferone) were also identified in analyzed material. There was no sign of arbutin or alkaloid trigonneline in tested sample.
Wstęp
Opis botaniczny rośliny
Ornithopus sativus Brot. (seradela siewna, syn. francuska) to uprawna roślina pastewna należąca do rodziny Fabaceae (bobowate) (1). Jest rośliną rozgałęzioną o pokroju początkowo wyprostowanym, z czasem płożącą (2). Łodyga wznosi się na wysokość 30-90 cm (1). Pędy są smukłe, dobrze wykształcone, krótko owłosione, gęsto ulistnione. Seradela ma cienkie, wykopodobne, nieparzysto pierzastozłożone, siedzące liście o długości 3-7 cm, liczące od 19 do 35 szeroko umiejscowionych, mniejszych listków o długości 4-13 mm i szerokości 3-6 mm. Są one koloru niebieskawozielonego (2, 3). Kwiaty są szypułkowate, baldachopodobne o długości 5-8 mm, typowego kształtu, koloru od różowego do białego, ułożone w grupy od 2 do 7 (2). Seradela wytwarza nasiona w skórzastych (łykowatych) strąkach, które mogą być podzielone na pojedyncze segmenty. Strąki są spłaszczone, proste albo nieznacznie skręcone, długości 12-25 mm, wąskie między nasionami, zwężające się ku górze. Zawierają od 3 do 7 pojedynczych dojrzewających nasion. Strąki występują na wysokości do 70 cm. Seradela wykształca nasiona żółtojasnobrązowe, podłużnego kształtu, długości od 1,5 do 3 mm, w liczbie 350-450 000/kg. Odznacza się głębokim systemem korzeniowym, dzięki któremu zdolna jest do zachowywania wilgoci oraz składników odżywczych w glebie (4).
Historia i występowanie
Seradela występuje głównie na suchych, piaszczystych glebach Portugalii, zachodniej i centralnej części Europy, w Australii i południowo-wschodniej części USA. Jest powszechnie uprawianą rośliną paszową na Półwyspie Iberyjskim i niektórych obszarach północnej części Afryki. W niektórych rejonach używana jest jako uprawna roślina paszowa (zielona i sucha pasza) albo jako zielony nawóz. Często rośnie w posianym zbożu i stosowana jest w płodozmianach w celu wzbogacenia gleby w azot.
Historia uprawy seradeli sięga XVIII wieku. Początkowo uprawiana była w Portugalii, skąd w XIX wieku rozprzestrzeniła się na Europę Zachodnią i Środkową. Ostatnio powierzchnie upraw w niektórych częściach Europy uległy zmniejszeniu. Intensywny program upraw został ustanowiony w Australii w celu przeprowadzania krzyżówek (hybrydyzacji), które zostały zastosowane, aby zwiększyć postęp hodowli (5). Hodowcy upraw we Francji wprowadzili kilka odmian, które są szeroko stosowane i używane głównie przez Australijczyków (6). Zdarza się, że na terenach uprawnych roślina ta dziczeje (2).
Cel pracy
Wiele roślin z rodziny Fabaceae, ze względu na bogactwo metabolitów wtórnych, wykazujących działanie farmakologiczne, jest używanych w medycynie konwencjonalnej oraz ludowej. Spośród substancji aktywnych, występujących w surowcach należących do tej rodziny, można wyróżnić: śluzy, alkaloidy, kumaryny, saponiny steroidowe i triterpenowe oraz w dużej ilości flawonoidy. Związki biologicznie aktywne występują w różnych częściach roślin z rodziny bobowatych. Można je znaleźć zarówno w kwiatach (Trifolii flos), korzeniach (Glycyrrhizae radix), nasionach (Glycine semen, Cytisi semen), jak również zielu (Meliloti herba, Trifolii herba, Genistae herba).
Seradela siewna (Ornithopus sativus), należąca do rodziny Fabaceae, jest rośliną uprawną o zastosowaniu paszowym, dlatego można przypuszczać, że nie zawiera ona związków szkodliwych lub trujących dla organizmów zwierzęcych. Ze względu na fakt, że wiele roślin – przedstawicieli rodziny bobowatych jest stosowanych w lecznictwie, można sądzić, że seradela również może zawierać metabolity wtórne o znaczeniu farmakologicznym.
Celem niniejszej pracy było opracowanie i zoptymalizowanie procesów izolacji substancji aktywnych z ziela Ornithopus sativus, ze szczególnym uwzględnieniem związków flawonoidowych, zoptymalizowanie warunków rozdziału metodą TLC uzyskanych związków oraz wstępna ich identyfikacja.
Materiał i metody
Materiał roślinny
Do badań użyto ziela seradeli siewnej (Ornithopus sativus). Nasiona rośliny zakupione zostały w firmie Małopolska Hodowla Roślin HBP sp. z o.o., a następnie wysiane na terenie Ogrodu Botanicznego w Mikołowie. Wysiewu nasion dokonano z końcem kwietnia 2012 roku, a zbioru ziela w sierpniu tego samego roku. Zebrane ziele wysuszono w zaciemnionym, przewiewnym pomieszczeniu. Wysuszony materiał roślinny przechowywano w ciemnym miejscu w papierowych opakowaniach.
Do badań ziele wstępnie pocięto, a następnie drobno zmielono i przechowywano w ciemnych, szklanych zamykanych naczyniach.
Reakcje jakościowe
W celu zidentyfikowania wybranych grup związków farmakologicznie aktywnych w badanym materiale wykonano reakcje charakterystyczne.
Obecność flawonoidów została określona za pomocą reakcji:
– Shinody: do 1 ml ekstraktu metanolowego (1 mg/ml) dodano opiłków cynku i niewielką objętość stężonego kwasu solnego; pozytywny wynik to zmiana barwy roztworu charakterystyczna dla danej grupy flawonoidów: pomarańczowe zabarwienie roztworu świadczy o obecności flawonów, malinowoczerwone – flawonoli, a fioletowoczerwone – flawononów; brak zabarwienia jest charakterystyczny dla chalkonów i auronów,
– reakcji z kwasem borowym: 2 ml ekstraktu metanolowego 1 mg/ml odparowano do sucha w porcelanowej parownicy, następnie do parownicy dodawano kwasu bornego (3 ml) o stężeniu 3% oraz kwasu szczawiowego (roztwór 10%) i kolejny raz poddawano całkowitemu odparowaniu; suchą pozostałość zawieszono w 10 ml eteru dietylowego i obserwowano pod lampą UV – fluorescencja w ultrafiolecie świadczy o obecności związków flawonoidowych.
Saponiny identyfikowano za pomocą próby pienienia: odważono 0,5 g ziela seradeli siewnej i przeniesiono do kolby o pojemności 25 ml, następnie dodano 10 ml 1% wodnego roztworu taniny w celu strącenia substancji białkowych i przesączono przez sączek do probówki, której zawartość wytrząsano przez 2 minuty – utrzymywanie się piany na powierzchni roztworu przez 60 sekund świadczy o obecności saponin w surowcu.
W celu zbadania obecności garbników wykorzystano wyciąg przygotowany w 50% metanolu (0,05 g/ml) i wykonano:
– próbę osadową: do 1 ml wyciągu metanolowego dodawano stopniowo 0,5% wodny roztwór żelatyny – obecność osadu jest wynikiem pozytywnym,
– reakcję z chlorkiem żelaza: do 1 ml wyciągu dodano kilka kropli 5% AlCl3; granatowe zabarwienie świadczy o obecności garbników hydrolizujących,
– reakcję z odczynnikiem wanilinowym: do 1 ml wyciągu dodano 0,25 ml roztworu waniliny w kwasie solnym. W przypadku obecności garbników skondensowanych wyciąg zabarwia się na czerwono (7).
Ekstrakcja związków farmakologicznie aktywnych
W celu wyizolowania aglikonów flawonoidów, do 2 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 2 ml 2M kwasu solnego i 10 ml acetonitrylu. Całość wytrząsano 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie płyn przesączono przez sączek karbowany i całkowicie odparowano. Suchą pozostałość rozpuszczono w 10 ml metanolu 80% i ponownie odparowywano do objętości 2 ml (8).
Dodatkowo dokonano modyfikacji hydrolizy kwasowej glikozydów flawonoidowych:
– do 2 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 5 ml acetonitrylu oraz 2 ml 2 M kwasu solnego. Po dwugodzinnym wytrząsaniu i przesączeniu przez sączek karbowany ekstrakt odparowano do suchej pozostałości na szkiełku zegarkowym. Następnie dodano 5 ml metanolu 80% i zagęszczono do objętości 2 ml,
– do 2 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 10 ml acetonitrylu oraz 2 ml 2 M kwasu solnego. Całość wytrząsano przez 2 godz. i przesączono przez sączek karbowany. Ekstrakt odparowano do suchej masy na szkiełku zegarkowym. Następnie dodano 5 ml metanolu 80% i zagęszczono do objętości 1 ml,
– do 4 g zmielonego ziela seradeli siewnej dodano 4 ml 2 M kwasu solnego oraz 20 ml acetonitrylu. Po dwugodzinnym wytrząsaniu wyciąg przesączono przez sączek karbowany na szkiełko zegarkowe i odparowywano na łaźni wodnej do suchej pozostałości. Następnie dodano 5 ml metanolu 80%.
Glikozydy flawonoidowe izolowano z surowca zgodnie z opisem zamieszczonym w Farmakopei Polskiej VI (9). Dokonano również ekstrakcji pozwalających na identyfikację arbutyny, trygoneliny i związków kumarynowych, zgodnie z procedurami opisanymi w piśmiennictwie (7, 10, 11).
Chromatografia cienkowarstwowa
Chromatografię cienkowarstwową wykonywano dwiema metodami – jedno- (1D TLC) i dwukierunkową (2D TLC).
W chromatografii jednokierunkowej zastosowano szereg układów rozwijających, wskazanych w publikacjach. Niektóre układy zmodyfikowano (tab. 1). W 2D TLC wykorzystano kombinacje faz ruchomych użytych w 1D TLC (tab. 2). Jako fazy stałej używano płytek pokrytych Silica Gel 60 F254 (Merck). Jako odczynnik wywołujący zastosowano Natural Products Reagent (Sigma).
Tab. 1. Wykaz zastosowanych układów rozwijających w 1D TLC
| Rozpuszczalniki | Proporcje | Źródło literaturowe |
| Dichlorometan:izopropanol | 95:5 (v/v) | (16) |
| Dichlorometan:izopropanol | 97,5:2,5 (v/v) | (16) |
| Dichlorometan:izopropanol | 90:10 (v/v) | (16) |
| Toluen:chloroform:aceton | 40:25:35 (v/v) | (17) |
| Octan etylu:kwas octowy:kwas mrówkowy:woda | 100:11:11:27 (v/v) | (9) |
| Chloroform:aceton:kwas mrówkowy | 75:16,5:8,5 (v/v) | (18) |
| Toluen:octan etylu:kwas octowy | 14:6:1 (v/v) | (11) |
| N-propanol:metanol:woda | 4:1:4 (v/v) | (10) |
| Octan etylu:metanol:woda | 100:17:13 (v/v) | (7) |
Tab. 2. Wykaz zastosowanych układów rozwijających w 2D TLC
| Kierunek 1 | Kierunek 2 |
Dichlorometan:izopropanol
(28,5:1,5 v/v) | Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v) |
Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v) | Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v) |
Dichlorometan:izopropanol
(25:5 v/v) | Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v) |
Dichlorometan
(30 v) | Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v) |
Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v) | Octan etylu:kwas octowy:kwas mrówkowy:woda
(100:11:11:27 v/v) |
Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v) | Chloroform:aceton:kwas mrówkowy
(75:16,5:8,5 v/v) |
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v) | Octan etylu:kwas octowy:kwas mrówkowy:woda
(100:11:11:27 v/v) |
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v) | Chloroform:aceton:kwas mrówkowy
(75:16,5:8,5 v/v) |
Toluen:chloroform:aceton
(40:25:35 v/v) | Dichlorometan:izopropanol
(28,75:1,25 v/v) |
Wyniki i dyskusja
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Rutkowski L. Klucz do oznaczania roślin naczyniowych Polski niżowej. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa 2008; 257. 2. Bajaj YPS. Medicinal and aromatic plants. XI Ornithopus sativus (seradella): in vitro culture, phytochemical studies, and biotransformations. Springer-Verlang, Berlin Heidelberg 1999; 311. 3. Revell C. French seradella – soft seeded 2007, http://www.pasturepicker.com.au/Html/French_serradella-soft_seeded.htm. 4. Craig A. Research scientist, seradella – a pasture legume for deep acid sands. Fact Sheet 2005; 137(33):1-4. 5. Hanelt P. Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research. Mansfield’s Encyclopedia of Agricultural and Horticultural Crops. Springer-Verlang, Berlin Heidelberg 2001; 819-21. 6. George RAT. Agricultural seed production. CABI 2011; 10:113-4. 7. Strzelecka H, Kamińska J, Kowalski J i wsp. Chemiczne metody badań roślinnych surowców leczniczych. Warszawa 1982; 146-7, 280. 8. Kim SH, Jung WS, Ahn JK i wsp. Analysis of isoflavone concentration in soybean (Glycine max L.) seeds between the cropping year and storage for 3 years. E Food Res Tech 2005; 220:207-14. 9. Farmakopea Polska. Wyd. VI. Polskie Towarzystwo Farmacetyczne, Warszawa 2002. 10. Chopra S, Ahmad FJ, Khar RK i wsp. Validated high-performance thin-layer chromatography method for determination of trigonelline in herbal extract and pharmaceutical dosage form. Anal Chim Acta 2006; 577:46-51. 11. Wichtl M. Herbal drugs and phytopharmaceuticals. A handbook for practice on a scientific basis. Med Pharm Scien Pub 2000. 12. Marais JPJ, Mueller-Harvey I, Brandt E i wsp. Polyphenols condensed tannins and other natural products in Onobrychis viciifolia Sainfoin. J Agric Food Chem 2000; 48:3440-7. 13. Jones WT, Broadhurrs RB, Lyttleton JW. The condensed tannins of pasture legume species. Phytochem 1976; 15:1407-9. 14. Khanbabaee K, van Ree T. Tannins: Classification and definition. Nat Prod Res 2001; 18:641-9. 15. Clinton C. Plant tannins: a novel approach to the treatment of ulcerative colitis. Nat Med J 2009; 1:1-3. 16. Lapcik O, Hill M, Cerny I i wsp. Immunoanalysis of isoflavonoids in Pisum sativum and Vigna radiate. Plant Sci 1999; 148:111-9. 17. Kotkar HM, Mendki PS, Sadan SV i wsp. Antimicrobial and pesticidal activity of partially purified flavonoids of Annona squamosa. Pest Manug Sci 2001; 58:33-7. 18. Wagner H, Bladt S. Plant drug analysis. A thin layer chromatography atlas. Springer-Verlag, Brooklyn, New York. 19. Krasteva I, Nicolova I, Danchev N i wsp. Phytochemical analysis of ethyl acetate extract from Astragalus corniculatus Bieb. and brain antihypoxic activity. Acta Pharm 2004; 5:151-6. 20. Onyilagha J, Islam S, Ntamatungiro S. Comparative phytochemistry of eleven species of Vigna Fabaceae. Biochem System Ecol 2009; 37:16-9. 21. Baginsky C, Pena-Neira A, Caceres A i wsp. Phenolic compound composition in immature seeds of fava bean Vicia faba L. varieties cultivated in Chile. J Food Compos Anal 2013; 31:1-6. 22. Miean KH, Mohamed S. Flavonoid myricetin, quercetin, kaempferol, luteolin, and apigenin content of edible tropical plants. J Agric Food Chem 2001; 49:3106-12. 23. Burghardt F. Uptake of flavonoids from Vicia villosa Fabaceae by the lycaenid butterfly, Polyommatus icarus Lepidoptera: Lycaenidae. Biochem Syst Ecol 1997; 6:527-36. 24. Garg A, Garg S, Zaneveld LJD i wsp. Chemistry and pharmacology of the citrus bioflavonoid hesperidin. Phytother Res 2001; 15:655-69. 25. Farah A, Monteiro M, Donangelo C i wsp. Chlorogenic acids from green coffee extract are highly bioavailable in humans. J Nutr 2008; 12(138):2309-15. 26. Kwok K, Shiyi O. Ferulic acid: pharmaceutical functions, preparation and applications in foods. J Sci F Agric 2004; 11(84):1261-9. 27. Gawlik-Idzik U. Fenolokwasy jako bioaktywne dodatki do żywności. ŻNTJ 2004; 4:29-40. 28. Vincent A, Fitzpatrick LA. Soy isoflavones: Are they useful in menopause? Mayo Clin Proc 2000; 11:1174-84. 29. Kaczmarczyk-Sedlak I, Wojnar W, Zych M i wsp. Effect of formononetin on mechanical properties and chemical composition of bones in rats with ovariectomy induced osteoporosis. Evid Based Compl Alt Med 2013; Article ID 457052:1-10. 30. Tamir S, Eizenberg M, Somjen D. Estrogenic and antiproliferative properties of glabridin from licorice in human breast cancer cells. Cancer Res 2000; 60:5704-9. 31. Zgórka G. Studies on phytoestrogenic and nonphytoestrogenic compounds in Trifolium incarnatum L. and other clover species using pressurized liquid extraction and high performance column liquid chromatography with photodiode-array and fluorescence detection. J AOAC Int 2011; 94:22-31. 32. Pietrzak S. Kwantyfikacja azotu wiązanego symbiotycznie przez rośliny motylkowate. Wod Środ Obsz Wiej 2011; 11:197-207. 33. Stougaard J. Regulators and regulation of legume root nodule development. Plant Phys 2000; 124:531-40. 34. Hirsch AM, Lum MR, Downie AJ. What makes the rhizobia-legume symbiosis so special. Plant Phys 2001; 127:1484-92. 35. Kozłowski S, Swędrzyński A, Zielewicz W. Rośliny motylkowate w środowisku przyrodniczym. Wod Środ Obsz Wiej 2011; 11:161-81. 36. Zechner S, Schrober G, Wenzel M i wsp. Expression of the Brachypodium japonicum type III secretion system in legume nodules and analysis of the associated tts box promoter. Mol Plant Microb Interact 2008; 8:1087-93. 37. Razavi Mehdi S. Plant coumarins as a allelopathic agents. Int J Biol Chem 2011; 1:86-90. 38. Cho Y, Lightfoot DAJ, Wood A. Trigonelline concentrations in salt stressed leaves of cultivated Glycine max. Phytochem 1999; 52:1235-8. 39. Bubenchikova VN, Drozdova IL. HPLC analysis of phenolic compounds in yellow sweet clover. Pharm Chem J 2004; 38:195-6.
