Katarzyna Chojnacka1, Katarzyna Owczarek1, Miłosz Caban1, Jakub Fichna1, Dorota Sosnowska2, Małgorzata Redzynia2, *Urszula Lewandowska1
Wpływ ekstraktów z liści kaliny koralowej (Viburnum opulus L.) na wzrost ludzkich komórek jelita
The impact of extracts from cranberrybush leaves (Viburnum opulus L.) on the growth of human colon cells
1Zakład Biochemii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Jakub Fichna
2Instytut Biochemii Technicznej, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. inż. Stanisław Bielecki
Streszczenie
Wstęp. Kalina koralowa (Viburnum opulus L.) jest rośliną bogatą w związki fenolowe. Za jej przeciwutleniające działanie odpowiedzialny jest głównie kwas chlorogenowy. Roślina ta wykazuje również właściwości przeciwbakteryjne oraz przeciwzapalne, dzięki temu jest wykorzystywana w zapobieganiu, a także w leczeniu wielu chorób, głównie układu moczowo-płciowego, ale również serca i płuc. Jest niewiele badań, które sugerują, iż V. opulus posiada działanie przeciwnowotworowe i mogłaby stać się uzupełnieniem tego typu terapii.
Cel pracy. Celem badań była ocena i porównanie wpływu ekstraktu z liści kaliny (ELK) oraz fenolowego ekstraktu z liści kaliny (FELK) na wzrost nowotworowych i prawidłowych komórek jelita.
Materiał i metody. Metoda HPLC pozwoliła na ocenę składu chemicznego ELK i FELK. Ponadto wykorzystano dwie linie komórkowe raka jelita grubego HT29 i SW480, a także prawidłowe komórki nabłonkowe CCD841CoN. Komórki traktowane były różnymi stężeniami ekstraktów z V. opulus. Przy zastosowaniu testu MTT oceniano żywotność komórek odpowiednio po 24, 48 i 72 godz.
Wyniki. Ekstrakty ELK oraz FELK wykazywały umiarkowany wpływ na hamowanie wzrostu komórek HT29. W przypadku linii SW480 efekt hamowania żywotności komórek był dużo wyraźniejszy. Ekstrakt FELK znacznie silniej hamował wzrost komórek nowotworowych HT29 i SW480 w porównaniu do ELK. Wzrost prawidłowych komórek CCD841CoN był wyższy po traktowaniu ich FELK niż ELK.
Wnioski. Ekstrakt oczyszczony FELK, bogatszy w związki fenolowe od nieoczyszczonego ELK, znacznie lepiej hamował wzrost komórek raka jelita grubego HT29 i SW480, a jednocześnie łagodniej działał na prawidłowe komórki nabłonkowe jelita CCD841CoN.
Summary
Introduction. Cranberrybush (Viburnum opulus L.) is a plant rich in phenols. Chlorogenic acid is a main compound responsible for its antioxidant activity. This plant also has antibacterial and anti-inflammatory properties, for this reason it is used for prevention, as well as for the treatment of many diseases, mainly those of the genitourinary tract, but also of the heart or lungs. So far, there are few studies that suggest V. opulus has anti-cancer activity and could become a supplement in such therapies.
Aim. The aim of the study was to assess and compare the effect of both leaf extract (ELK) and phenol-rich leaf extract from cranberrybush (FELK) on the growth of colon cancer and normal colon cells.
Material and methods. The HPLC method allowed to estimate the chemical composition of ELK and FELK. In addition, two colon cancer cell lines HT29 and SW480 were used, as well as normal epithelial cells CCD841CoN. The cells were treated with various concentrations of V. opulus extracts. The cell viability was assessed by MTT test after 24 h, 48 h and 72 h, respectively.
Results. ELK and FELK extracts had moderate effect on the inhibition of HT29 cell growth. The cell viability of SW480 was much more pronounced after ELK and FELK treatment. The FELK extract inhibited the growth of HT29 and SW480 more significantly compared to ELK. The growth of CCD841CoN cells was higher after FELK treatment than ELK.
Conclusions. The purified leaf extract of V. opulus (FELK) was richer in phenolic compounds than the unpurified ELK, more significantly inhibited the growth of HT29 and SW480 colon cancer cells as well as had a more gentle influence on the growth of normal epithelial CCD841CoN colon cells.
Wstęp
Nowotwory są drugą co do częstości przyczyną zgonów na świecie i pomimo iż w ostatnich latach wskaźniki zapadalności i śmiertelności słabną, to nadal zapobieganie i leczenie stanowią poważny problem. Rak jelita grubego odpowiada za około 9% wszystkich zgonów i jest to trzeci najczęściej diagnozowany nowotwór (1-3).
Istnieje wiele czynników warunkujących rozwój raka jelita grubego, wśród nich wyróżnić można: wiek, dietę, palenie tytoniu, stany zapalne jelita, obecność zespołu metabolicznego, występowanie polipów w jelicie grubym oraz czynniki genetyczne. Bieżące dane pokazują również, iż odsetek zachorowań oraz zgonów na raka jelita grubego obniżył się w przeciągu ostatniej dekady o 3%, co jest głównie wynikiem wdrożenia badań przesiewowych, szerszego wykorzystania technik endoskopowych, chirurgicznych oraz chemioterapii (1). Niemniej jednak chemioterapia często wiąże się z szeregiem skutków ubocznych, dlatego też wiele badań skupia się na poszukiwaniu nowych metod leczenia. W ostatnim czasie wzrosło zainteresowanie metodami fitoterapeutycznymi, które mogłyby stać się uzupełnieniem leczenia konwencjonalnego.
Liczne badania pokazują, że związki pochodzenia roślinnego, w tym polifenole, terpenoidy oraz alkaloidy, wykazują potencjał leczniczy i skutecznie regulują mechanizmy komórkowe odpowiedzialne za procesy karcynogenezy (4). Do tej pory dobrze poznano antynowotworową aktywność pojedynczych związków polifenolowych, takich jak: resweratrol występujący w winogronach, galusan epigallokatechiny (EGCG) w zielonej herbacie, kurkumina czy genisteina (5, 6). Przyjmowanie naturalnych ekstraktów roślinnych bogatych w związki polifenolowe niesie za sobą także korzystne skutki, co zostało niejednokrotnie potwierdzone w testach in vitro oraz in vivo (7-10).
Wiele badań wskazuje, że spożywanie pokarmów bogatych w substancje przeciwutleniające obniża ryzyko rozwoju wielu chorób (11, 12). Istnieje wiele prac, które dowodzą, że dieta bogata w polifenole reguluje niekorzystny poziom reaktywnych form tlenu (RFT) (13, 14). Polifenole ze względu na swoje właściwości przeciwutleniające i przeciwzapalne skutecznie zmniejszają ryzyko wystąpienia wielu chorób, w tym naczyniowo-sercowych, cukrzycy, alergii i nowotworów, wykazują także działanie przeciwgrzybicze oraz wzmacniają odporność (15, 16). Rosnące w ostatnich latach zainteresowanie naturalnymi składnikami żywności stało się istotnym czynnikiem rozwoju badań koncentrujących się na mniej znanych roślinach.
Wiele gatunków roślin jagodowych, w tym kalina koralowa (Viburnum opulus L.) z rodziny Przewiertniowatych, okazuje się być wartościowym źródłem bioaktywnych związków (17, 18). Roślina ta występuje w Europie, Azji Północnej, Azji Południowej oraz centralnej części Rosji. Owoce kaliny są jadalne i wykorzystywane w medycynie ludowej, przemyśle spożywczym oraz farmaceutycznym. Stosuje się je w leczeniu chorób serca, płuc, nerek, cukrzycy, problemów trawiennych, a także kaszlu czy przeziębienia (19).
Wiele prac pokazuje związek między właściwościami leczniczymi V. opulus a zawartością polifenoli, kwasów fenolowych, w tym kwasu chlorogenowego, flawonoidów, antocyjanów oraz kwasów organicznych, takich jak kwas askorbinowy oraz kwas jabłkowy (10, 11, 13, 14). Ponadto badania in vitro potwierdziły, iż ekstrakt z V. opulus wykazuje działanie przeciwutleniające (18, 20-22). Inne prace, prowadzone na wielu bakteriach i grzybach chorobotwórczych dla człowieka, dowiodły przeciwdrobnoustrojowej aktywności V. opulus (23). W badaniach in vitro oraz in vivo odnotowano także przeciwzapalny potencjał ekstraktu z kaliny, pod wpływem którego obniżeniu uległy poziomy prozapalnych cytokin oraz zahamowane zostały procesy zapalne związane z tworzeniem się obrzęków (24). Ekstrakt z V. opulus wydaje się być również cenny ze względu na łagodzenie uszkodzeń układu rozrodczego, co zostało wykazane w badaniach prowadzonych na szczurach (25, 26). Celem niniejszej pracy było sprawdzenie, czy związki fenolowe występujące w ekstraktach z liści V. opulus mają wpływ na przeżywalność komórek nowotworowych gruczolakoraka jelita grubego HT-29 i SW480 oraz prawidłowych nabłonkowych komórek jelita CCD841CoN.
Cel pracy
Celem badań była ocena i porównanie wpływu dwóch ekstraktów (nieoczyszczonego – ELK i oczyszczonego – FELK) pozyskanych z liści kaliny koralowej (Viburnum opulus L.) na żywotność komórek nowotworowych jelita SW480 i HT-29 oraz prawidłowych komórek nabłonka jelita CCD841CoN.
Materiał i metody
Odczynniki
W eksperymentach wykorzystano bromek 3-(4,5--dimetylo-tiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) oraz odczynnik Folina-Ciocalteu, a także galusan (–)-epigalokatechiny (EGCG), antybiotyki (penicylina i streptomycyna), trypsynę, roztwór PBS, płodową surowicę bydlęcą (FBS), L-glutaminę i podłoża hodowlane (DMEM, EMEM, RPMI-1640) zakupione w firmie Sigma-Aldrich Chemical Co. (USA). Natomiast pozostałe użyte w badaniach odczynniki chemiczne pochodziły z firmy POCH S.A. (Polska).
Materiał roślinny
Liście kaliny koralowej (Viburnum opulus L.) pochodziły z Leśnego Zakładu Doświadczalnego SGGW Arboretum w Rogowie.
Otrzymywanie ekstraktu z liści kaliny
Rozdrobnione wysuszone liście homogenizowano przy prędkości 20 000 obr./min przez 1 min w 70% wodnym roztworze metanolu (1:10, w/v), a następnie prowadzono proces ekstrakcji przez 30 min z zastosowaniem mieszadła magnetycznego. Następnie mieszaninę wirowano (10 min, 5000 obr./min), a otrzymany osad ponownie ekstrahowano przez 30 min z użyciem 100% metanolu w stosunku 1:5 (w/v). Uzyskane ekstrakty połączono i zagęszczono celem usunięcia metanolu. Wodne ekstrakty odtłuszczono, stosując 7-10-krotną ekstrakcję dichlorometanem (1:1, v/v), a po odparowaniu pozostałości dichlorometanu liofilizowano. Liofilizaty (ELK) do czasu analizy przechowywano w temperaturze 4°C.
Oczyszczanie ekstraktu z liści kaliny
Oczyszczanie związków polifenolowych prowadzono metodą SPE (Solid Phase Extraction) na kolumienkach Sep-Pak C18 z zastosowaniem 12-pozycyjnego próżniowego zestawu do SPE firmy BioAnalytic (27). Na aktywowane metanolem i wodą destylowaną (po 40 ml) kolumienki Sep-Pak C18 (Waters, 10 g) nanoszono nieoczyszczony ekstrakt polifenolowy w ilości 0,5-1 g/10 ml wody. Złoże przemywano wodą destylowaną (100 ml) celem usunięcia związków niepolifenolowych, takich jak cukry i kwasy organiczne, a zaadsorbowane związki fenolowe wymywano 100 ml metanolu. Otrzymany eluat, po dodaniu 30 ml wody, zatężano na wyparce próżniowej, a otrzymaną wodną próbę liofilizowano. Liofilizat (FELK) przechowywano do czasu analizy w temperaturze 4°C.
Analiza związków polifenolowych
Analizę związków polifenolowych wykonano przy użyciu chromatografu cieczowego HPLC firmy Waters, wyposażonego w detektor PDA-996 (Photodiode Array Detector) (2998), autosampler 2707, pompę gradientową 1525 oraz oprogramowanie Waters Breeze 2. Do badań zastosowano kolumnę Symmetry C18 (5 μm) (Waters) o wymiarach 250 x 4,6 mm. Szybkość przepływu fazy ruchomej wynosiła 1 ml/min. Dla badanych prób wykonywano widma poszczególnych pików w przedziale długości fali od 200 do 400 nm. Fazę ruchomą stanowił układ rozpuszczalników: (A) woda/kwas mrówkowy (90:10 v/v) oraz (B) woda/acetonitryl/kwas mrówkowy (40:50:10 v/v/v). Analizę związków polifenolowych prowadzono w następującym gradiencie: 0 min – 88% A, 0-26 min – 70% A, 26-40 min – 0% A, 40-43 min – 0% A, 43-48 min – 88% A, 48-50 min – 88% A (28).
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Siegel R, Miller K, Jemal A. Cancer statistics 2017. CA Cancer J Clin 2017; 67(1):23.
2. Siegel R, Miller K, Jemal A. Cancer Statistics 2015. CA Cancer J Clin 2015; 65(1):5-29.
3. Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R i wsp. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Intern J Cancer 2015; 136(5):E359-86.
4. Chojnacka K, Lewandowska U. Chemopreventive effects of polyphenol-rich extracts against cancer invasiveness and metastasis by inhibition of type IV collagenases expression and activity. J Funct Foods 2018; 6:295-311.
5. Singh BN, Singh HB, Singh A i wsp. Dietary phytochemicals alter epigenetic events and signaling pathways for inhibition of metastasis cascade: Phytoblockers of metastasis cascade. Cancer Metastasis Rev 2014; 33(1):41-85.
6. Patel VB, Misra S, Patel BB i wsp. Colorectal cancer: Chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer 2010; 62:958-67.
7. Owczarek K, Lewandowska U. The impact of dietary polyphenols on COX-2 expression in colorectal cancer. Nutr Cancer 2017; 69(8):1105-18.
8. Lewandowska U, Owczarek K, Szewczyk K i wsp. Influence of polyphenol extract from evening primrose (Oenothera paradoxa) seeds on human prostate and breast cancer cell lines. Post Hig Med Dośw 2014; 68:110-8.
9. Seo EY, Kim WK. Red ginseng extract reduced metastasis of colon cancer cells in vitro and in vivo. J Ginseng Res 2011; 35(3):315-24.
10. Wu C-H, Yang M-Y, Lee Y-J i wsp. Nelumbo nucifera leaf polyphenol extract inhibits breast cancer cells metastasis in vitro and in vivo through PKCα targeting. J Funct Foods 2017; 37:480-90.
11. Azzini E, Maiani G. Mediterranean Diet: Antioxidant nutritional status. W: The Mediterranean Diet: An Evidence-Based Approach 2014; 249-57.
12. Scoditti E, Calabriso N, Massaro M i wsp. Mediterranean diet polyphenols reduce inflammatory angiogenesis through MMP-9 and COX-2 inhibition in human vascular endothelial cells: A potentially protective mechanism in atherosclerotic vascular disease and cancer. Arch Biochem Biophys 2012; 527(2):81-9.
13. Kim JA, Kong CS, Seo YW i wsp. Sargassum thunbergii extract inhibits MMP-2 and -9 expressions related with ROS scavenging in HT1080 cells. Food Chem 2010; 120(2):418-25.
14. Cerqueira FM, De Medeiros MHG, Augusto O. Dietetic antioxidants: Controversies and perspectives. Quim Nova 2007; 30(2):441-9.
15. Russo GL, Tedesco I, Spagnuolo C i wsp. Antioxidant polyphenols in cancer treatment: Friend, foe or foil? Semin Cancer Biol 2017; 46(5):1-13.
16. Stoclet JC, Chataigneau T, Ndiaye M i wsp. Vascular protection by dietary polyphenols. Eur J Pharmacol 2004; 500(1-3 Spec Iss):299-313.
17. Karaçelik AA, Küçük M, Iskefiyeli Z i wsp. Antioxidant components of Viburnum opulus L. determined by on-line HPLC-UV-ABTS radical scavenging and LC-UV-ESI-MS methods. Food Chem 2015; 175:106-14.
18. Kraujalyte V, Venskutonis PR, Pukalskas A i wsp. Antioxidant properties and polyphenolic compositions of fruits from different European cranberrybush (Viburnum opulus L.) genotypes. Food Chem 2013; 141(4):3695-702.
19. Tuglu D, Yılmaz E, Yuvanc E i wsp. Viburnum opulus: could it be a new alternative, such as lemon juice, to pharmacological therapy in hypocitraturic stone patients? Arch Ital Urol Androl 2014; 86(4):297-9.
20. Cam M, Hisil Y, Kuscu A. Organic acid, phenolic content, and antioxidant capacity of fruit flesh and seed of Viburnum opulus. Chem Nat Comp 2007; 43(4):460-1.
21. Andreeva T, Komarova E, Yusubov M i wsp. Medicinal plants: antioxidant activity of cranberry tree (Viburnum opulus L.) bark extract. Pharm Chem J 2004; 38(10):54-60.
22. Rop O, Reznicek V, Valsikova M i wsp. Antioxidant properties of European cranberrybush fruit (Viburnum opulus var. edule). Molecules 2010; 15(6):4467-77.
23. Sagdic O, Aksoy A, Ozkan G. Evaluation of the antibacterial and antioxidant potentials of cranberry (gilaburu, Viburnum opulus L.) fruit extract. Acta Aliment 2006; 35(4):487-92.
24. Moldovan B, David L, Vulcu A i wsp. In vitro and in vivo anti-inflammatory properties of green synthesized silver nanoparticles using Viburnum opulus L. fruits extract. Mater Sci Eng C 2017; 79:720-7.
25. Sarıözkan S, Türk G, Eken A i wsp. Gilaburu (Viburnum opulus L.) fruit extract alleviates testis and sperm damages induced by taxane-based chemotherapeutics. Biomed Pharmacother 2017; 95:1284-94.
26. Saltan G, Süntar I, Ozbilgin S i wsp. Viburnum opulus L.: A remedy for the treatment of endometriosis demonstrated by rat model of surgically-induced endometriosis. J Ethnopharmacol 2016; 193:450-5.
27. Georgè S, Brat P, Alter P i wsp. Rapid determination of polyphenols and vitamin C in plant-derived products. J Agric Food Chem 2005; 53(5):1370-3.
28. Dyrby M, Westergaard N, Stapelfeldt H. Light and heat sensitivity of red cabbage extract in soft drink model systems. Food Chem 2001; 72(4):431-7.
29. Hussain SA, Sulaiman AA, Balch C i wsp. Natural polyphenols in cancer chemoresistance. Nutr Cancer 2016; 68:879-91.
30. Rady I, Mohamed H, Rady M i wsp. Cancer preventive and therapeutic effects of EGCG, the major polyphenol in green tea. Egypt J Basic Appl Sci 2018; 5(1):1-23.
31. Chidambara-Murthy KN, Jayaprakasha GK, Patil BS. Citrus limonoids and curcumin additively inhibit human colon cancer cells. Food Funct 2013; 4(5):803-10.
32. Zhang CX, Wang SM, Jin HY. Inhibitory effect and mechanism of (–)-epigallocatechin-3-gallate on HT29 and HCT-8 colorectal cancer cell lines and expression of HES1 and JAG1. Zhonghua wei Chang wai ke za zhi 2011; 14(8):636-9.
33. Cui X, Jin Y, Hofseth AB i wsp. Resveratrol suppresses colitis and colon cancer associated with colitis. Cancer Prev Res 2010; 3(4):549-59.
34. Ilhan M, Ergene B, Süntar I i wsp. Preclinical evaluation of antiurolithiatic activity of Viburnum opulus L. on sodium oxalate-induced urolithiasis rat model. Evid Based Compl Altern Med 2014; 2014.
35. Altun ML, Saltan Çito?lu G, Sever Yilmaz B i wsp. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of Viburnum opulus. Pharm Biol 2009; 47(7):653-8.
36. Altun ML, Erdogan-Orhan I. Anti-acetylcholinesterase and antioxidant assets of the major components (salicin, amentoflavone, and chlorogenic acid) and the extracts of Viburnum opulus and Viburnum lantana and their total phenol and flavonoid contents. J Med Food 2010; 13(6):1537-43.
37. El-Gamal AA. Cytotoxic lupane-, secolupane-, and oleanane-type triterpenes from Viburnum awabuki. Nat Prod Res 2008; 22(3):191-7.
38. Fukuyama Y, Minoshima Y, Kishimoto Y i wsp. Cytotoxic iridoid aldehydes from Taiwanese Viburnum luzonicum. Chem Pharm Bull 2005; 53(1):125-7.
39. Shen YC, Lin CL, Chien SC i wsp. Vibsane diterpenoids from the leaves and flowers of Viburnum odoratissimum. J Nat Prod 2004; 67(1):74-7.
40. Rios MY, González-Morales A, Villarreal ML. Sterols, triterpenes and biflavonoids of Viburnum jucundum and cytotoxic activity of ursolic acid. Planta Med 2001; 67(7):683-4.
41. Ulger H, Ertekin T, Karaca O i wsp. Influence of gilaburu (Viburnum opulus) juice on 1,2-dimethylhydrazine (DMH)-induced colon cancer. Toxicol Ind Health 2013; 29(9):824-9.
42. Zayachkivska OS, Gzhegotsky MR, Terletska OI i wsp. Influence of Viburnum opulus proanthocyanidins on stress-induced gastrointestinal mucosal damage. J Physiol Pharmacol 2006; 57(Suppl 5):155-67.
43. Ceylan D, Aksoy A, Ertekin T i wsp. The effects of gilaburu (Viburnum opulus) juice on experimentally induced Ehrlich ascites tumor in mice. J Cancer Res Ther 2018; 14(2).
