*Magdalena Woźniak1, Lucyna Mrówczyńska2, Agnieszka Waśkiewicz1, Marta Babicka1, Elżbieta Hołderna-Kędzia3, Izabela Ratajczak1
Zawartość związków fenolowych w ekstrakcie z propolisu oraz ocena jego aktywności przeciwutleniającej i cytoochronnej względem erytrocytów ludzkich w warunkach stresu oksydacyjnego in vitro
The content of phenolic compounds in propolis extract and estimation of its antioxidant and in vitro cytoprotective activity in human erythrocytes under oxidative stress
1Katedra Chemii, Wydział Technologii Drewna, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
Kierownik Katedry: dr hab. n. leśn. Izabela Ratajczak
2Zakład Biologii Komórki, Wydział Biologii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Kierownik Zakładu: dr hab. n. biol. Andrzej Lesicki, prof. UAM
3Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu
Dyrektor Instytutu: dr hab. inż. Małgorzata Zimniewska, prof. IWNiRZ
Streszczenie
Wstęp. Propolis (kit pszczeli) jest naturalnym produktem zbieranym przez pszczoły miodne z pączków różnych gatunków drzew, krzewów oraz innych gatunków roślin. Ekstrakty z propolisu wykazują liczne właściwości biologiczne, w tym właściwości przeciw-utleniające, przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze i przeciwnowotworowe. Z tego powodu, propolis ma wiele zastosowań i wykorzystywany jest m.in. w preparatach na przeziębienie, w preparatach dermatologicznych lub jako składnik suplementów diety i zdrowej żywności. Skład chemiczny tego naturalnego produktu jest bardzo złożony i zależy od wielu czynników, w tym od metody ekstrakcji czy wybranego rozpuszczalnika.
Cel pracy. Celem pracy było określenie stężenia wybranych związków fenolowych (flawonoidów oraz kwasów fenolowych) w ekstrakcie z polskiego propolisu oraz ocena jego aktywności przeciwutleniającej i oddziaływania na ludzkie erytrocyty w warunkach in vitro.
Materiał i metody. W ekstrakcie z propolisu oznaczono stężenie 14 flawonoidów oraz 9 kwasów fenolowych z zastosowaniem ultrasprawnej chromatografii cieczowej z detekcją fotodiodową oraz masową. Aktywność przeciwutleniającą ekstraktu z propolisu oceniono, określając jego zdolność do neutralizacji kationorodnika DPPH˙ oraz redukcji jonów Fe3+ do Fe2+. Ponadto, oceniono aktywność hemolityczną ekstraktu oraz aktywność cytoprotekcyjną względem erytrocytów ludzkich poddanych działaniu wolnych rodników w warunkach in vitro.
Wyniki. Ekstrakt z propolisu zawierał wysokie stężenie pinocembryny, galanginy, chryzyny, apigeniny, kemferolu, kwasu kumarowego oraz kwasu cynamonowego. Wykazano wysoką aktywność przeciwutleniającą ekstraktu. Aktywność przeciwrodnikowa ekstraktu odpowiadała około 75% aktywności standardowych przeciwutleniaczy: Troloksu oraz BHT, zaś siła redukcyjna była równa około 65% aktywności Troloksu i około 80% aktywności BHT. Ponadto nie odnotowano hemolitycznej aktywności ekstraktu oraz wykazano jego cytoochronne działanie wobec erytrocytów ludzkich eksponowanych na działanie wolnych rodników w warunkach in vitro.
Wnioski. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że ekstrakt z propolisu pochodzenia krajowego jest bogatym źródłem flawonoidów oraz kwasów fenolowych. Powyższy fakt tłumaczy jego wysoką aktywność przeciwutleniającą oraz efektywność ochraniającą erytrocyty przed hemolizą oksydacyjną.
Summary
Introduction. Propolis (bee glue) is a natural product collected by honeybees from buds of various trees, shrubs and other plant species. Extracts of propolis possess numerous biological activities, including antioxidant, antibacterial, antifungal and anticancer. For this reason, propolis is currently used in many applications, such as preparations for cold syndrome, dermatological preparations or as a constituent of nutritional supplements and health food. The chemical composition of this natural material is very complex and depending on many factors, including method of extraction and selection of the solvent for the extraction process.
Aim. The aim of the study was to determine concentration of selected phenolic compounds (flavonoids and phenolic acids) in extract of Polish propolis and estimate its antioxidant activity and effect on human red blood cells.
Material and methods. In the propolis extract was determined concentration of 14 flavonoids and 9 phenolic acids using ultra-performance liquid chromatography equipped with a photodiode detector and a triple quadrupole mass spectrometer. The antioxidant potential of propolis extract was evaluated applying DPPH˙ free radical scavenging activity assay and Fe3+ reducing power assay. Moreover, the cytotoxicity and cytoprotective potential of propolis extract was estimated using human erythrocytes in vitro.
Results. The propolis extract contained high concentration of pinocembrin, galangin, chrysin, apigenin, kaempferol, coumaric acid and cinnamic acid. It exhibited also high antioxidant potential. The antiradical activity of examined propolis extract was equal to 75% approx. activity of both standard antioxidants used in the study, namely Trolox and BHT. The reducing power of extract was equal to 65% approx. of Trolox and 80% of BHT, respectively. The propolis extract had no hemolytic activity, moreover, effectively protected human erythrocytes against free radicals-induced damage in vitro.
Conclusions. The results of this study indicate that the propolis extract of national origin is a rich source of flavonoids and phenolic acids. Therefore, the propolis extract possesses a high antioxidant potential and can protect erythrocytes against free radicals-induced oxidative hemolysis.
Wstęp
Propolis (kit pszczeli) jest naturalnym produktem zbieranym przez pszczoły z różnych części drzew, krzewów i innych roślin zielonych. Pszczoły wykorzystują propolis jako materiał uszczelniający i tworzący barierę chroniącą wnętrze ula przed drobnoustrojami chorobotwórczymi (1, 2). W medycynie ludowej zastosowanie propolisu sięga czasów starożytnych, kiedy Rzymianie wykorzystywali jego właściwości do balsamowania ciał zmarłych (3). Obecnie propolis stosowany jest w różnej postaci (m.in. ekstrakty, kapsułki, maści i kremy) w wielu gałęziach gospodarki. Zastosowanie propolisu w farmacji, kosmetologii czy przemyśle spożywczym wynika z jego korzystnych właściwości biologicznych (1-3).
Dane piśmiennictwa wskazują, że ekstrakty z propolisu charakteryzują się m.in. właściwościami przeciwnowotworowymi, przeciwgrzybiczymi, przeciwbakteryjnymi oraz przeciwutleniającymi (3-8). Aktywność biologiczna propolisu związana jest z jego złożonym składem chemicznym. Najczęściej wymienianą grupą związków warunkującą korzystne właściwości propolisu są związki fenolowe – flawonoidy oraz kwasy fenolowe i ich estry (2, 9). Dowiedziono, że związki te są najczęściej oznaczaną grupą substancji w propolisie pochodzącym z różnych regionów geograficznych, m.in. Słowenii, Włoch, Chin czy Hiszpanii (6, 8-10). Spośród fenoli, w propolisie pochodzenia krajowego najczęściej potwierdza się obecność chryzyny, galanginy, kemferolu, naryngeniny, kwercetyny, pinobanksyny, a także kwasów: kumarowego, ferulowego, cynamonowego i kawowego (4, 5, 11-14). Poza tym oprócz wspomnianych związków fenolowych w próbkach propolisu różnego pochodzenia zidentyfikowano także inne grupy związków, w tym kwasy tłuszczowe, ketony, węglowodany, terpeny, aldehydy oraz makro- i mikroelementy (4, 7, 16, 17).
Ważnym zagadnieniem związanym z badaniami dotyczącymi składu chemicznego propolisu jest wybór metody ekstrakcji, zwłaszcza dobór odpowiedniego rozpuszczalnika. Do procesu ekstrakcji związków biologicznie aktywnych z propolisu stosowane są różne rozpuszczalniki chemiczne, w tym najczęściej alkohol etylowy o różnym udziale wody, alkohol metylowy, aceton, chloroform, a także woda (8, 18-21). Zgodnie z danymi piśmiennictwa, wybór rozpuszczalnika do ekstrakcji surowca wpływa nie tylko na jego skład chemiczny, ale także na aktywność biologiczną, w tym na właściwości przeciwutleniające, przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze (21, 22).
Cel pracy
Celem pracy było określenie stężenia wybranych związków fenolowych (flawonoidów i kwasów fenolowych) w ekstrakcie z krajowego propolisu oraz ocena jego aktywności przeciwutleniającej i cytoochronnej względem erytrocytów ludzkich poddanych działaniu wolnych rodników w warunkach in vitro.
Materiał i metody
Ekstrakcja propolisu
W badaniach wykorzystano ekstrakt z propolisu otrzymany w wyniku ekstrakcji surowca pochodzenia krajowego acetonem (Avantor Performance Materials Poland SA) w stosunku 1:10 (m/v). Proces ekstrakcji prowadzono przez okres 5 dni w temperaturze pokojowej z wykorzystaniem wytrząsarki (Biosan). Następnie ekstrakt przesączono i odparowano rozpuszczalnik z wykorzystaniem wyparki próżniowej (Buchi Labortechnik AG). Suchą pozostałość rozpuszczono w alkoholu metylowym o czystości HPLC (Sigma-Aldrich) do analiz chemicznych oraz w dimetylosulfotlenku (Avantor Performance Materials Poland SA) do określenia aktywności przeciwutleniającej oraz wpływu ekstraktu z propolisu na erytrocyty.
Oznaczenie stężenia związków fenolowych
W ekstrakcie z propolisu oznaczono stężenie wybranych związków fenolowych za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej z detekcją fotodiodową (λ = 280 oraz 309 nm) oraz masową (Aquity UPLC/PDA/TQD, Waters Company). W badanym materiale analizowano stężenie flawonoidów (apigenina, chryzyna, epikatechina, galangina, genisteina, kwercetyna, mirycetyna, naryngenina, pinobanksyna, pinocembryna, katechina, kemferol, pinostrobina, rutyna) oraz kwasów fenolowych (chlorogenowy, ferulowy, p-hydroksybenzoesowy, kawowy, p-kumarowy, syryngowy, synapinowy, wanilinowy, cynamonowy), których standardy pochodziły z firmy Sigma-Aldrich. Identyfikację jakościową i ilościową związków fenolowych przeprowadzono z użyciem kolumny chromatograficznej (Acquity UPLC HSS T3 firmy Waters, 1,8 μm, 2,1 x 150 mm), stosując jako fazę nośną roztwory: linia A – 0,1% wodny roztwór kwasu mrówkowego; linia B – 0,1% roztwór kwasu mrówkowego w acetonitrylu (Sigma-Aldrich) w trybie gradientowym. Identyfikacji jonów macierzystych dokonywano, stosując jonizację typu Elektrospray. Oznaczenia stężenia poszczególnych związków fenolowych dla badanego ekstraktu z propolisu wykonano w trzech powtórzeniach, a prezentowane wyniki są wartością średnią.
Aktywność przeciwutleniająca
Ocena aktywności przeciwutleniającej w teście DPPH˙
Do 0,2 ml ekstraktu z propolisu o stężeniu 0,1 mg/ml dodano 0,2 ml świeżo przygotowanego etanolowego roztworu 0,1 M DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylo-hydrazyl) (Sigma-Aldrich) i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez dostępu światła. Następnie mierzono absorbancję roztworów z wykorzystaniem spektrofotometru Epoll 2000 ECO (PZ Emco) przy długości fali λ = 517 nm. Jako związki referencyjne zastosowano BHT (butylowany hydroksytoluen) oraz Troloks (Sigma-Aldrich) w identycznych stężeniach jak próba badana. Na podstawie wartości absorbancji obliczono aktywność przeciwrodnikową (AP), stosując następujące równanie:
AP (%) = [(A0-A1)/A0] x 100,
gdzie: A0 – absorbancja próby kontrolnej, A1 – absorbancja ekstraktu z propolisu.
Analizę aktywności przeciwrodnikowej ekstraktu z propolisu w teście z kationorodnikiem DPPH˙ wykonano trzykrotnie w trzech powtórzeniach każdej próby, a przedstawione wyniki są wartością średnią.
Ocena aktywności przeciwutleniającej w teście redukcji jonów Fe3+
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Toreti VC, Sato HH, Pastore GM i wsp. Recent progress of propolis for its biological and chemical compositions and its botanical origin. Evid Based Compl Alt 2013; 2013:697390.
2. Castaldo S, Capasso F. Propolis, an old remedy used in modern medicine. Fitoterapia 2002; suppl. 1:S1-S6.
3. Wagh VD. Propolis: A wonder bees product and its pharmacological potentials. Evid Based Compl Alt 2013; 2013:308249.
4. Popova M, Giannopoulou E, Skalicka-Woźniak K i wsp. Characterization and biological evaluation of propolis from Poland. Molecules 2017; 22:1159.
5. Szliszka E, Sokół-Łętowska A, Kucharska AZ i wsp. Ethanolic extract of Polish propolis: chemical composition and TRAIL-R2 death receptor targeting apoptotic activity against prostate cancer cells. Evid Based Compl Alt 2013; 2013:757628.
6. Ahn MR, Kumazawa S, Usui Y i wsp. Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various areas of China. Food Chem 2007; 101:1383-92.
7. Kalogeropoulos N, Konteles SJ, Troullidou E i wsp. Chemical composition, antioxidant activity and antimicrobial properties of propolis extracts from Greece and Cyprus. Food Chem 2009; 116:452-61.
8. Mavri A, Abramovic H, Polak T i wsp. Chemical properties and antioxidant and antimicrobial activities of Slovenian propolis. Chem Biodivers 2012; 9:1545-57.
9. Pellati F, Orlandini G, Pinetti D i wsp. HPLC-DAD and HPLC-MS/MS methods for metabolite profiling of propolis extracts. J Pharm Biomed Anal 2011; 55:934-48.
10. Kumazawa S, Bonvehi JS, Torres C i wsp. Chemical and functional characterization of propolis collected from East Andalusia (Southern Spain). Phytochem Anal 2013; 24:608-15.
11. Socha R, Gałkowska D, Bugaj M i wsp. Phenolic composition and antioxidant activity of propolis from various regions of Poland. Nat Prod Res 2015; 29(5):416-22.
12. Kędzia B. Skład chemiczny propolisu polskiego. Cz. I. Początkowy okres badań. Post Fitoter 2009; (1):39-44.
13. Kędzia B. Skład chemiczny propolisu polskiego. Cz. II. Nowe badania. Post Fitoter 2009; (2):122-8.
14. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna propolisu pochodzącego z różnych regionów świata. Post Fitoter 2006; (1):23-35.
15. Woźniak M, Kwaśniewska-Sip P, Babicka M i wsp. Skład chemiczny etanolowego ekstraktu z propolisu i jego aktywność biologiczna wobec grzybów pleśniowych. Post Fitoter 2018; 19(2):86-91.
16. Mohammadzeh S, Shariatpanahi M, Hamedi M i wsp. Chemical composition, oral toxicity and antimicrobial activity of Iranian propolis. Food Chem 2007; 103:1097-103.
17. Woźniak M, Babicka M, Rissmann I i wsp. Etanolowe ekstrakty z propolisu jako źródło biopierwiastków. Post Fitoter 2018; 19(2):81-5.
18. Miguel MG, Nunes S, Dandlen SA i wsp. Phenols, flavonoids and antioxidant activity of aqueous and methanolic extracts of propolis (Apis mellifera L.) from Algarve, South Portugal. Food Sci Technol 2014; 34(1):16-23.
19. Papotti G, Bertelli D, Bortolotti L i wsp. Chemical and functional characterization of Italian propolis obtained by different harvesting methods. J Agric Food Chem 2012; 60:2852-62.
20. Narimane S, Demircan E, Salah A i wsp. Correlation between antioxidant activity and phenolic acids profile and content of Algerian propolis: Influence of solvent. Pak J Pharm Sci 2017; 30(4):1417-23.
21. Cottica SM, Sawaya ACHF, Eberlin MN i wsp. Antioxidant activity and composition of propolis obtained by different methods of extraction. J Braz Chem Soc 2011; 22(5):929-35.
22. Kacaniova M, Vukovic N, Chlebo R i wsp. The antimicrobial activity of honey, bee pollen loads and beeswax from Slovakia. Arch Biol Sci 2012; 64(3):927-34.
23. Kumazawa S, Hamasaka T, Nakayama T. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins. Food Chem 2004; 84:329-39.
24. Majewska E, Trzanek J. Właściwości przeciwutleniające miodów wielokwiatowych i innych produktów pszczelich. Brom Chem Toksykol 2009; 4:1089-94.
25. Righi AA, Alves TR, Negri G i wsp. Brazilian red propolis: unreported substances, antioxidant and antimicrobial activities. J Sci Agric 2011; 91:2363-70.
26. Jasiewicz B, Mrówczyńska L, Malczewska-Jaskóła K. Synthesis and haemolytic activity of novel salts made of nicotine alkaloids and bile acids. Bioorg Med Chem Lett 2014; 24:1104-7.
