*Elżbieta Hołderna-Kędzia
Działanie przeciwbakteryjne etanolowych ekstraktów z propolisu (EEP)
Antibacterial activity of ethanolic extracts of propolis (EEP)
Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich – Państwowy Instytut Badawczy, Poznań
p.o. Dyrektora Instytutu: dr n. med. inż. biotech. Rafał Spachacz
Streszczenie
Wprowadzenie. Silne właściwości biologiczne, a zwłaszcza przeciwdrobnoustrojowe, są przyczyną wzrostu zapotrzebowania przemysłu na propolis i uzyskane z niego ekstrakty. Otrzymany etanolowy ekstrakt z propolisu (EEP) po zagęszczeniu do ok. 67-70% s.m. stanowi podstawę do wytwarzania wszystkich obecnych na rynku preparatów propolisowych.
Cel pracy. Badania miały na celu ocenę aktywności przeciwbakteryjnej ekstraktów etanolowych z propolisu na przestrzeni lat 1979-2022.
Materiał i metody. W badaniach uwzględniono145 próbek zagęszczonych ekstraktów etanolowych z propolisu (EEP). Oznaczenia wykonywano metodą seryjnych rozcieńczeń w podłożu płynnym, określając najmniejsze stężenie ekstraktu w μg/ml hamujące wzrost szczepu standardowego gronkowca złocistego – Staphylococcus aureus (MIC – minimum inhibitory concentration). Badane próbki rozcieńczano w płynnym podłożu bakteriologicznym (Tryptic Soy Broth, Merck) w stężeniu 300 μg/ml. Otrzymane roztwory podstawowe służyły do przygotowania rzędów rozcieńczeń w zakresie od 30 do 300 μg/ml, do których dodawano hodowlę szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus 209P FDA o gęstości komórek 104-105/ml. Odczyty najmniejszych stężeń ekstraktów propolisowych hamujących wzrost szczepu wzorcowego wykonywano po 18 godz. inkubacji próbek w temperaturze 37°C.
Wyniki. Wyniki oceniano w oparciu o wymagania zawarte w normach zakładowych i Normie Polskiej (nie więcej niż 270 μg/ml, nie mniej niż 3700 J. A./g). Wśród 145 przebadanych ekstraktów etanolowych z propolisu najwięcej prób, tj. 45 (31,47%), wykazało aktywność MIC = 120 μg/ml; 8.300 J.A./g, 35 prób (24,47%) – MIC = 90 μg/ml; 11.100 J.A./g, a 16 próbek (6,99%) – MIC = 150 μg/ml; 6.670 J.A./g. Wśród pozostałych 47 próbek ekstraktów znajdowały się próby ekstraktów zarówno o niskiej (MIC = 400-500 μg/ml; 2500-2000 J.A./g), jak i o wysokiej aktywności przeciwbakteryjnej (MIC = 30-100 μg/ml; 33.000-10.000 J.A./g).
Wnioski. Większość przebadanych próbek ekstraktów propolisowych (137; 94,41%) odznaczała się wysoką aktywnością przeciwbakteryjną i odpowiadała wymaganiom normatywnym.
Summary
Introduction. Strong biological properties, especially antimicrobial characteristics, are the reason for the increased demand for propolis and its extracts in industry. Ethanol propolis extract (EEP), after concentration to approx. 67-70% by weight is a material for producing all propolis preparations available on the market.
Aim. The paper compares the antimicrobial activity of ethanol propolis extract samples tested from 1979-2022.
Material and methods. One hundred forty-five samples of concentrated ethanol extracts from propolis were investigated. The microbiological standardization in force in our country was followed. The determinations were performed using the method of serial dilutions in the liquid medium, determining the lowest concentration of the extract in μg/ml that inhibited the growth of the standard strain of Staphylococcus aureus (MIC – minimum inhibitory concentration). Test samples were diluted in a liquid bacteriological medium (Tryptic Soy Broth, Merck) at 300 μg/ml concentration. The obtained stock solutions were used to prepare rows of dilutions ranging from 30 to 300 μg/ml, to which a culture of the standard Staphylococcus aureus 209P FDA strain with a cell density of 104-105/ml was added. The lowest concentrations of propolis extracts that inhibit the growth of the reference strain were read after 18 hours. incubation of samples at 37°C.
Results. The results were assessed based on the requirements of the relevant company standards and the Polish Standard (not more than 270 μg/ml, not less than 3700 J.A./g). Among 145 tested ethanol extracts from propolis, the most significant number of samples, i.e., 45 (31.47%), showed activity MIC = 120 μg/ml; 8.300 IU/g, 35 trials (24.47%) – MIC = 90 μg/ml; 11,100 IU/g and 16 samples (6.99%) – MIC = 150 μg/ml; 6.670 J.A./g. Among the remaining 47 samples of extracts, there were extract samples with both low (MIC = 400-500 μg/ml; 2500-2000 J.A./g) and high antibacterial activity (MIC = 30-100 μg/ml; 33,000-10,000 J.A./g).
Conclusions. Most of the concentrated ethanol extracts of propolis (137; 94.41%) were characterized by high and medium microbiological activity and met the normative requirements.
Słowa kluczowe: etanolowe ekstrakty propolisowe (EEP), działanie przeciwbakteryjne, najmniejsze stężenie hamujące, jednostki antybiotyczne
Wprowadzenie
Zainteresowanie propolisem ze względu na jego zróżnicowany skład chemiczny i wszechstronne właściwości biologiczne utrzymuje się niezmiennie od szeregu lat. Składniki biologicznie aktywne zawarte w ekstraktach zapewniają szerokie spektrum aktywności w zakresie działania przeciwdrobnoustrojowego, przeciwzapalnego, ułatwiającego gojenie ran i oparzeń, przeciwbólowego, przeciwutleniającego i wielu innych. Wśród właściwości biologicznych propolisu ważne miejsce zajmuje jego silne działanie przeciwdrobnoustrojowe. Z tego względu stanowi on naturalną alternatywę dla antybiotyków i preparatów przeciwdrobnoustrojowych. Szczególne znaczenie zyskują wówczas ekstrakty i preparaty wytworzone na bazie propolisu. Ważnym powodem skierowania zainteresowań świata medycznego propolisem jest również problem narastania antybiotykooporności o różnym mechanizmie działania (szczepy MRSA – methicillin resistant Staphylococcus aureus, ESBL – Enterobacteriaceae susceptibility B-lactamase, MDR – multidrug resistant bacteria). Uważa się, że aktywność przeciwbakteryjna propolisu jest wypadkową synergistycznego działania flawonoidów, kwasów aromatycznych i seskwiterpenów. Wśród szczególnie wartościowych właściwości ekstraktów propolisowych wymienić można działanie antybiotyczne (bakterie, grzyby, wirusy chorobotwórcze dla człowieka i zwierząt), odnawiające tkanki, w tym miękką, łączną, chrzęstną i zębową, wzmagające ziarninowanie, gojenie i bliznowacenie ran (1), możliwości wykorzystania propolisu w ochronie zdrowia ludzi i zwierząt (1, 2). W badaniach klinicznych potwierdzono jego wspomagające działanie w leczeniu różnych chorób skóry, w tym: oparzeń i odleżyn, owrzodzeń żylakowych podudzi i egzem skórnych (3). Jest ono przyczyną wzrostu zapotrzebowania przemysłu na surowy propolis i uzyskane z niego ekstrakty. Silna aktywność w tym zakresie warunkuje wyjątkową skuteczność preparatów propolisu w leczeniu chorób zewnętrznych o etiologii drobnoustrojowej. Do celów leczniczych szczególnie przydatne są ekstrakty z propolisu odznaczające się wysoką aktywnością biologiczną. Istotne jest użycie do ekstrakcji próbek surowca wysokiej jakości, tj. o odpowiedniej zawartości substancji biologicznie aktywnych, zapewniających szerokie spektrum działania na drobnoustroje. Warunkiem pozyskania wartościowego, aktywnego antybiotycznie produktu pszczelego jest przede wszystkim zrównoważona gospodarka pasieczna. Dla zachowania równowagi pszczelarz nie powinien pobierać od jednej rodziny pszczelej więcej niż 80 do 100 g surowego propolisu. W przeciwnym razie pozyskany propolis nie gwarantuje wysokiej aktywności otrzymanych ekstraktów.
Skład chemiczny propolisu
Według Wojtackiego (4) w składzie surowego propolisu znajdują się następujące grupy substancji naturalnych: substancje żywiczne (45%), substancje balsamiczne (12%), wosk roślinny (8%), wosk pszczeli (25%) i zanieczyszczenia mechaniczne (10%), co zamieszczono w tabeli 1. Aby wykorzystać propolis do celów praktycznych (profilaktycznych, leczniczych i innych), należy go oczyścić, aby usunąć składniki nierozpuszczalne za pomocą ekstrakcji etanolem 70%. W ten sposób otrzymuje się etanolowy ekstrakt z propolisu (EEP) pozbawiony wosku pszczelego i zanieczyszczeń mechanicznych, który może być wykorzystany do dalszego przerobu technologicznego.
Tab. 1. Skład surowego propolisu (4)
| Grupy składników aktywnych | Zawartość (%) |
| Substancje żywiczne | 45 |
| Substancje balsamiczne | 12 |
| Wosk roślinny | 8 |
| Wosk pszczeli | 25 |
| Zanieczyszczenia | 10 |
Badania biochemiczne wykazały, że w ekstrakcie z propolisu reprezentowane najliczniej są takie związki, jak: flawonoidy z grup: flawonów, flawonoli, flawanonów i flawanonoli, aglikony: chryzyna, tektochryzyna, pinostrobina, apigenina, chalkon pinostrobinowy, kwasy aromatyczne (kwasy fenolowe: benzoesowy, cynamonowy, kawowy, ferulowy), estry alkoholi i kwasów aromatycznych. Średnia zawartość związków fenolowych wynosi ok. 50%, w tym samych kwasów fenolowych do 22% oraz do kilkunastu procent pochodnych tych związków (m.in. ester fenyloetylowy kwasu kawowego – CAPE). W mniejszych ilościach znajdują się: kwasy tłuszczowe, terpeny, węglowodory, aminokwasy, enzymy i biopierwiastki (5-8). Skład chemiczny etanolowego ekstraktu z propolisu przedstawiono w tabeli 2.
Tab. 2. Składniki biologicznie aktywne EEP
| Składniki | Średnia zawartość (%) |
| Związki aromatyczne – kwasy aromatyczne – kwasy fenolowe, alkoholofenole, estry i etery aromatyczne | 77 |
| Flawonoidy (chryzyna, tektochryzyna, akacetyna, galangina, kemferol, kwercetyna, pinostrobina, pinocembryna, pinobanksyna) | 8 |
| Terpeny (frakcja lotna: geraniol, nerol, borneol) | 1 |
| Substancje lipidowo-woskowe – kwasy tłuszczowe nienasycone – estry metylowe i etylowe kwasu kawowego, cynamonowego | 10 |
| Biopierwiastki (mangan, cynk, miedź, żelazo, krzem, glin) | 1 |
| Inne substancje (witaminy z gr. B, białka i enzymy, wolne aminokwasy, cukry) | 3 |
Działanie przeciwdrobnoustrojowe propolisu
Według obszernych danych literaturowych, ekstrakty z propolisu hamują rozwój takich grup drobnoustrojów, jak: bakterie Gram-dodatnie (Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Bacillus cereus), bakterie Gram-ujemne (Escherichia coli, Salmonella enteritidis), grzyby drożdżoidalne (Candida albicans), grzyby pleśniowe (Aspergillus flavus, Penicillium italicum) (5, 9-11). Piśmiennictwo zawiera również informacje dotyczące podwyższenia aktywności antybiotycznej antybiotyków i chemioterapeutyków w wyniku stosowania ich łącznie z propolisem (12).
Przygotowywanie ekstraktów
Na przestrzeni wielu lat, począwszy od lat 70. XX wieku, przygotowywano i analizowano pod względem składu chemicznego i aktywności przeciwdrobnoustrojowej ekstrakty z propolisu sporządzone przy użyciu różnych rozpuszczalników. Do tego celu najczęściej stosowano: roztwory etanolu w wodzie (7,5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 60%, 70%, 80%, 95%, 96%), metanol, chlorek metylenu (7,5%), eter, wodę i olej. Badania te wykonywano m.in. w Zakładzie Farmakognozji AM w Poznaniu, gdzie propolis był także tematem prac magisterskich (13, 14). Prowadzono m.in. badania ekstrakcyjne zmierzające do otrzymania biologicznie aktywnych frakcji z propolisu. W Pracowni Mikrobiologicznej ówczesnego Instytutu Roślin i Przetworów Zielarskich wykonywano natomiast oznaczenia aktywności przeciwbakteryjnej wspomnianych frakcji. Uzyskane wyniki prezentowano następnie podczas obrad V Międzynarodowego Sympozjum Apiterapii w Krakowie (15, 16).
Doświadczalnie wykazano, że najlepszym rozpuszczalnikiem do ekstrakcji surowego propolisu jest 70% alkohol etylowy, który daje znacznie lepsze efekty ekstrakcyjne w porównaniu z 96% etanolem (17-19).
Otrzymany etanolowy ekstrakt z propolisu (EEP) po zagęszczeniu do ok. 67-70% suchej masy tego surowca (przeciętnie 65% s.m.) jest produktem wyjściowym do wytwarzania wszystkich obecnych na rynku preparatów propolisowych. Sposób ten umożliwia dogodną standaryzację preparatu, która polega na oznaczaniu aktywności mikrobiologicznej ekstraktu. W celu przygotowania handlowych postaci płynnych, zagęszczony ekstrakt etanolowy rozcieńcza się w 70% alkoholu etylowym do uzyskania roztworu o odpowiednim stężeniu (20).
Przeprowadzone w ostatnim czasie badania własne wskazują ponadto na skuteczne działanie na drobnoustroje poszukiwanych na rynku preparatów bezalkoholowych z propolisu. Do tego celu wykorzystuje się ekstrakty otrzymane przy pomocy takich rozpuszczalników, jak: glikol propylenowy, glicerol lub inny nośnik. Zgodnie z danymi piśmiennictwa w pierwszym etapie przygotowuje się ekstrakt etanolowy z propolisu, a następnie po zagęszczeniu w warunkach próżniowych rozpuszcza się pozostałość w odpowiednim rozpuszczalniku w proporcji 1:10 i uzyskuje tzw. 10% kompleks bezalkoholowy. Taki proces zapewnia wysoką aktywność biologiczną uzyskanych preparatów, porównywalną z aktywnością ekstraktów etanolowych. Przyjmuje się je w dawkach podobnych jak w przypadku etanolowych kropli z tego produktu (21). Natomiast w celu otrzymania ekstraktów wodnych z propolisu surowiec ekstrahuje się przy użyciu wody destylowanej w określonej temperaturze 25-121°C, w czasie trwania ekstrakcji (10 min-96 godz.) oraz przy odpowiednim stosunku surowca do wody (1:1 – 1:37,5), z zastosowaniem dodatkowych procesów wspomagających ekstrakcję (mieszanie, ultradźwięki, solubilizacja) (22-25). Ze względu na niską zawartość związków flawonoidowych w ekstraktach wodnych, podaje się je w wyższych dawkach w porównaniu z ekstraktami etanolowymi (25). Do celów kosmetycznych wykorzystuje się często ekstrakty wodne, glikolowe i olejowe.
Metody standaryzacji propolisu
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Kędzia B. Pozyskiwanie i zagospodarowanie kitu pszczelego (propolisu). Możliwości wykorzystania propolisu w ochronie ludzi i zwierząt. Mat Konf VI Kraj Nauk-Techn Konf Pszczel, Częstochowa 06.12.2000; 24-29.
2. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Wpływ propolisu na odnowę tkanki skórnej, kostnej, chrzęstnej i zębowej. Post Fitoter 2018; (2):203-11.
3. Dzierżewicz Z, Stojko A, Stojko J, Stojko R. Techniki biologii molekularnej, hodowle komórkowe i organotypowe w ocenie właściwości farmakologicznych standaryzowanych frakcji produktów pszczelich. XLI Nauk Konf Pszczel, Puławy 2004:130-2.
4. Wojtacki M. Produkty pszczele i przetwory miodowe. PWRiL, Warszawa 1988.
5. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Biologiczne właściwości propolisu. I. Działanie wyciągów z propolisu na drobnoustroje. Herba Polon 1985; (3-4):219-32.
6. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Skład chemiczny propolisu w świetle dotychczasowych badań. Herba Polon 1991; (2):95-110.
7. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Sposoby standaryzacji preparatów propolisowych. Herba Polon 1993; (4):227-32.
8. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna propolisu pochodzącego z różnych rejonów świata. Post Fitoter 2006; (1):23-34.
9. Kędzia B. Przeciwdrobnoustrojowe działanie etanolowego ekstraktu z propolisu (EEP). Dokumentacja tematu Nr 3-73. Inst Rośl Przetw Ziel, Poznań 1974.
10. Starzyk J, Doleżal M. Badania nad działaniem propolisu na drobnoustroje bakteryjne oporne na antybiotyki. V Międzynar Symp Apiter, Kraków 1985. Zagadn Wybr Wyd Pol Zw Pszczel, Kamianna 1986:116-9.
11. Kędzia B, Kędzia A, Dutko P i wsp. Działanie propolisu krajowego na drobnoustroje chorobotwórcze pochodzące od ludzi i zwierząt. Post Fitoter 2009; (2):98-105.
12. Ratajczak M, Kamińska D, Matuszewska E i wsp. Promising antimicrobial properties of bioactive compounds from different honeybee products. Molecules 2021; 26 (13):4007.
13. Pniewska DŁ. Poszukiwanie składników propolisu o działaniu biologicznym. Praca magisterska. AM w Poznaniu 1979.
14. Toboła E. Związki flawonoidowe propolisu. Praca magisterska. AM w Poznaniu 1979.
15. Kędzia B, Ellnain-Wojtaszek M, Bylka W i wsp. Aktywność mikrobiologiczna różnych frakcji propolisu. V Międzynar Symp Apiter Mat Konf Kraków 1985:18.
16. Żelisławska R. Chemiczna analiza frakcji propolisu. Praca magisterska. AM w Poznaniu 1984.
17. Lutomski J, Speichert H, Kędzia B i wsp. Ustalenie aktywnych biologicznie komponentów spożywczych i składu chemicznego propolisu w aspekcie preparatów spożywczych, ewentualnie parafarmaceutycznych. Dokumentacja tematu Nr 4/78. Inst Rośl Przetw Ziel, Poznań 1978.
18. Rybak-Chmielewska H, Szczęsna T. Wpływ różnych rozpuszczalników na aktywność biologiczną propolisu. Pszczeln Zesz Nauk 1991; 35:55-62.
19. Tichonow AI, Jarnych TG, Czernych WP i wsp. Teoria i praktyka wytwarzania leczniczych preparatów propolisowych. Wyd Apipol-Farma, Myślenice 2006.
20. Kędzia B. Możliwości wykorzystania propolisu w ochronie zdrowia ludzi i zwierząt. VI Krajowa Nauk-Techn Konf Pszczel, Częstochowa 2000:24-9.
21. Czarnecki R. Propolis w apiterapii. Kraków 2015:38-40.
22. Scheller S, Rogala D, Stasiak E i wsp. Antibacterial properties of propolis. Pol Arch Wet 1968; 11:391-8.
23. Salomon B, Sven E. Increasing the solubility of propolis in water. Patent duński. 133584. Chem Abstr 1976; 25:198170b.
24. Omarow SM. Apiterapija. Produkty pczełowodstwa w mirie mediciny. Rostow-na Donu, Wyd Feniks 2009:120-5.
25. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Wodne ekstrakty z propolisu. Pasieka 2019; 5:52-4.
26. Ellnain-Wojtaszek M, Marciniak A, Kowalewski Z i wsp. Standaryzacja wyciągów z propolisu za pomocą ilościowego oznaczania flawonoidów. Herba Polon 1990; (36):145-53.
27. Kędzia B, Mścisz A, Jankowiak J i wsp. Porównanie mikrobiologicznych, chemicznych, farmakologicznych i biochemicznych metod standaryzacji propolisu. 8 Międzynar Symp Apiter, Portoroż 17-19 września 1998:91.
28. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Sposoby standaryzacji preparatów propolisowych. Herba Polon 1993; (4):227-32.
29. Kiwman GJ, Kagramanowa KA, Szub TA. Method of determining the antimicrobial activity of propolis. Antibiotiki 1978; 9:792.
30. Pepelnjak S, Jalsenjak I, Maysinger D. Growth inhibition of bacillus subtilis and composition of various propolis extracts. Pharmazie 1982; 37:864.
31. Polska Norma PN-A-77627. Koncentrat propolisu, lipiec 1996.
32. Norma Zakładowa ZN-91/1-1. Zagęszczony ekstrakt propolisowy, sierpień 1991.
33. ZN-97/KP-FA-2 Norma Producenta. Koncentrat Propolisu, czerwiec 1997.
34. Meresta T, Meresta L. Zagadnienie oceny aktywności antybakteryjnej ekstraktów propolisu. V Miedzynar Symp Apiter, Wyd Pol Zw Pszczel Kraków-Kamianna 1986:103-7.
