© Borgis - Nowa Medycyna 1/2009, s. 43-47
*Magdalena Druszczyńska, Dominik Strapagiel, Wiesława Rudnicka
Molekularne i komórkowe parametry w gruźlicy
Molecular and cellular parameters in tuberculosis
Zakład Immunologii Komórkowej, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Uniwersytet Łódzki
Kierownik Katedry: prof. dr hab Wiesława Rudnicka
Streszczenie
Background: One third of the human population is infected with Mycobacterium. tuberculosis, but only 5-10% of the infected subjects develop active disease. The host genetic background that determines macrophage and T-lymphocyte immune responses is considered as one of the causes of the diversified course of M. tuberculosis infection. It is possible that the different activity of macrophages, becoming apparent during mycobacterial infection, can be a factor that determines susceptibility/resistance of humans to tuberculosis.
Aim: The aim of the study was to estimate a potential role of the polymorphisms of genes cd14, tlr2, tlr4, mbl-2 and slc11a1, encoding products important for macrophage functions, in susceptibility/resistance of humans to tuberculosis. Considering the importance of TNF-α and IL-12 in the cellular immunity to mycobacteria the in vitro production of that cytokines by PBML stimulated with alive BCG bacilli was estimated.
Material and methods: A group of 283 volunteers, including 147 patients with tuberculosis and 136 healthy volunteers with no tuberculosis history was included into the study. The polymorphism of examined genes was determined using PCR or PCR-RFLP techniques. Serum sCD14 and MBL concentrations as well as levels of TNF-α and IL-12 produced by macrophages were tested by ELISA.
Results: There was no association between the polymorphism of examined genes and IL-12 and TNF-α secretion by BCG-stimulated macrophages from patients with tuberculosis and healthy controls. BCG-stimulated TNF-α and IL-12 production was found to be significantly decreased in patients with tuberculosis compared with healthy controls.
Conclusions: Decreased TNF-α and IL-12 production by macrophages may promote the development of mycobacteria and play an important role in the development of active tuberculosis.
Wstęp
Gruźlica stanowi wciąż olbrzymi problem biomedyczny na świecie. Szacuje się, że blisko 1/3 populacji przeszła zakażenie prątkami Mycobacterium. Każdego roku notuje się 7-10 milionów nowych zachorowań i 2 miliony zgonów spowodowanych tą chorobą. Poważnym problemem stojącym przed klinicystami jest szybko wzrastająca częstość izolowania prątków opornych na leki przeciwgruźlicze oraz notowana coraz częściej koinfekcja z HIV (1).
Wieloletnie badania epidemiologiczne wskazują, że na gruźlicę zapada nie więcej niż 10% osób, które uległy zakażeniu prątkami gruźlicy. Za przyczynę zróżnicowanego przebiegu zakażenia prątkami gruźlicy uznaje się podłoże genetyczne gospodarza warunkujące odpowiedź immunologiczną makrofagów oraz limfocytów T na antygeny tych bakterii (2).
Prątki przedostające się w kroplach aerozolu do dystalnych części układu oddechowego ulegają fagocytozie przez makrofagi alweolarne (3). Wiązanie bakterii i ich pochłanianie odbywa się przy współudziale receptorów PRR (pattern recognition receptors) rozpoznających wzorce strukturalne patogenów, takich jak cząsteczki Toll-like, CD14 czy receptory mannozowe (4, 5, 6, 7). Pobudzenie makrofagów przez związanie ligandów przez receptory prowadzi do aktywacji czynników transkrypcyjnych, w tym czynnika NFkb, nieodzownych dla pobudzenia produkcji cytokin i ekspresji cząsteczek kostymulujących. Odpowiadając na sygnały bakteryjne makrofagi uwalniają IL-12 promującą rozwój limfocytów Th1 i aktywującą komórki T i NK do produkcji IFN-γ, który nasila aktywność prątkobójczą makrofagów. Komórki makrofagowe wydzielają również monokiny zapalne (TNF-α, IL-1) angażujące w reakcję limfocyty o różnej swoistości antygenowej, jak i inne komórki zapalne (8, 9).
Cel
Doceniając kluczową rolę makrofagów w przebiegu zakażeń mykobakteriami i towarzyszących im reakcjach odpornościowych, uzasadnione jest pytanie, czy zróżnicowana aktywność tych komórek ujawniająca się podczas zakażenia prątkami gruźlicy może pozostawać w związku ze zróżnicowanym przebiegiem takich zakażeń. Odpowiedzi na takie pytanie można szukać badając polimorfizm genów, których produkty są istotne dla przebiegu interakcji makrofagów z mykobakteriami – CD14, TLR2, TLR4, MBL oraz badając aktywność makrofagów in vitro, ocenianą na podstawie produkcji IL-12 i TNF-α w hodowlach zakażanych prątkami BCG.
Materiał i metody
Badaniami objęto grupę 283 ochotników, w tym 147 pacjentów z aktywną gruźlicą płuc, potwierdzoną w badaniu mikroskopowym plwociny i metodą hodowli, oraz 136 wiekowo dobranych ochotników z grupy kontrolnej, którzy nigdy nie chorowali na gruźlicę, do której zaliczono 68 osób zdrowych w momencie prowadzenia badań oraz 68 osób z różnymi chorobami płuc, z wykluczeniem obecnej lub przebytej gruźlicy. Od wszystkich ochotników pobierano próbki krwi w celu izolacji genomowego DNA, uzyskania surowicy oraz przygotowania frakcji komórek jednojądrzastych (PBML). Zróżnicowanie genów kodujących cząsteczki CD14 oraz SLC11A1 określano wykorzystując reakcję łańcuchowej polimerazy. Polimorfizm genów tlr2, tlr4oraz mbl oceniano techniką PCR-RFLP. Zawartość rozpuszczalnej formy CD14 (sCD14) oraz MBL w surowicy, a także poziom cytokin (TNF-α, IL-12) wydzielanych przez stymulowane antygenami prątków BCG makrofagi oceniano immunoenzymatycznie.
Wyniki
Uzyskane wyniki nie wykazały związku pomiędzy występowaniem polimorfizmu genów tlr2 (R677W, R753Q) tlr4 (D299G, T399I), oraz slc11a1 (INT-4) i zwiększonym ryzykiem zachorowania na gruźlicę (tab. 1, 2). Badania dotyczące genów cd14 (-159 C/T) i mbl-2 (kodony 52, 54, 57) również nie wykazały znamiennej roli tych polimorfizmów w patogenezie gruźlicy w badanej kaukaskiej populacji Polaków (tab. 3).
Tabela 1. Polimorfizm genów tlr2 i tlr4 u osób z grupy kontrolnej i pacjentów z gruźlicą.
| | tlr2 R753Q
liczba osób (%) | tlr4 D299G
liczba osób (%) | tlr4 D299G
liczba osób (%) |
| R/R | R/Q | Q/Q | D/D | D/G | G/G | T/T | T/I | I/I |
| Grupa kontrolna | 119
(89%) | 14
(11%) | 0 | 119
(89%) | 14
(11%) | 0 | 119
(89%) | 14
(11%) | 0 |
| Pacjenci z gruźlicą | 132
(90%) | 15
(10%) | 0 | 131
(89%) | 16
(11%) | 0 | 132
(90%) | 15
(10%) | 0 |
| OR (95%CI) | 1,035
(0,48-2,23) | 0,966
(0,45-2,08) | - | 0,963
(0,45-2,06) | 1,038
(0,49-2,22) | - | 1,035
(0,48-2,06) | 0,966
(0,45-2,08) | - |
| p | p>0,05 | p>0,05 | - | p>0,05 | p>0,05 | - | p>0,05 | p>0,05 | - |
Tabela 2. Polimorfizm genów slc11a1 u osób z grupy kontrolnej i pacjentów z gruźlicą.
| | slc11a1 |
| G/G | G/C | C/C |
| Grupa kontrolna | 79 (60%) | 47 (36%) | 5 (4%) |
| Pacjenci z gruźlicą | 85 (58%) | 54 (37%) | 8 (5%) |
| OR (95%CI) | 0,902 (0,56-1,46) | 1,037 (0,64-1,69) | 1,450 (0,46-4,55) |
| p | p>0,05 | p>0,05 | p>0,05 |
Tabela 3. Polimorfizm genów cd14 i mbl-2 u osób z grupy kontrolnej i pacjentów z gruźlicą.
| | cd14
liczba osób (%) | mbl-2
liczba osób (%) |
| CC | CT | TT | A | B | C | D |
| Grupa kontrolna | 44 (33%) | 64 (47%) | 27 (20%) | 69 (57%) | 36 (30%) | 2 (2%) | 13 (11%) |
| Pacjenci z gruźlicą | 58 (39%) | 66 (45%) | 23 (16%) | 93 (63%) | 31 (21%) | 3 (2%) | 20 (14%) |
| OR (95%CI) | 1,348 (0,83-2,2) | 0,904 (0,57-1,44) | 0,742 (0,4-1,37) | 1,273 (0,78-2,08) | 0,624 (0,36-1,09) | 1,229 (0,2-7,48) | 1,296 (0,62-2,73) |
| p | p>0,05 | p>0,05 | p>0,05 | p>0,05 | p>0,05 | p>0,05 | p>0,05 |
W badaniach stwierdzono znamiennie podwyższoną zawartość rozpuszczalnej formy CD14 (sCD14) w surowicach pacjentów z gruźlicą (2781 ± 1214 ng/ml) w porównaniu do poziomu tej cząsteczki w surowicach osób z grupy kontrolnej (1578 ± 416 ng/ml).
Prowadzone badania wykazały zależność pomiędzy polimorfizmem tego genu i stężeniem MBL w surowicy. Mutacje w kodonach 52, 54 i 57 mbl-2powodowały znamienne obniżenie stężenia surowiczej MBL.U chorych na gruźlicę, z każdym wariantem allelicznym genu mbl-2stwierdzono statystycznie istotny wzrost poziomu MBL (średnio 1211 ± 1394 ng/ml) w porównaniu do poziomu lektyny w surowicach grupy kontrolnej (572 ± 743ng/ml).
Pomimo dużego zróżnicowania osobniczego w badaniach zaobserwowano znamiennie zredukowaną zdolność produkowania TNF-α i IL-12 w odpowiedzi na prątki BCG przez PBML pacjentów z gruźlicą (tab. 4). Średnie stężenie tych cytokin wykrywane w stymulowanych BCG hodowlach komórek wynosiło 690 ± 644 pg/ml dla TNF-α oraz 1,92 ± 2,3 pg/ml dla IL-12. Upośledzenie to pozostawało niezależne od polimorfizmu genów cd14, mbl-2, tlr2, tlr4 i scl11a1oraz zawartości sCD14 i MBL w surowicy. Dla porównania średni poziom TNF-α oraz IL-12 produkowany przez PBML osób zdrowych, bez infekcji w trakcie prowadzenia badań wynosił odpowiednio 2405 ± 2200 pg/ml oraz 5,5 ± 1,2 pg/ml. Zawartość TNF-α oraz IL-12 w pobudzanych BCG hodowlach ochotników z innymi niż gruźlica chorobami płuc znacznie różniła się od podanego wyżej stężenia cytokin produkowanych przez komórki osób zdrowych, bez infekcji w czasie badania, odpowiednio 686 ± 750 pg/ml dla TNF-α oraz 9 ± 11 pg/ml dla IL-12, co zasugerowało odrębną analizę aktywności sekrecyjnej makrofagów tych dwóch populacji osób z grupy kontrolnej.
Dyskusja
Wyniki licznych badań populacyjnych oraz doświadczalnych, prowadzonych na modelach zwierzęcych wskazują, iż prawdopodobnie liczne geny mają znaczenie w podatności/odporności na gruźlicę. Ważną rolę w tym procesie mogą odgrywać takie geny, których produkty regulują interakcje pomiędzy Mycobacterium tuberculosis, a komórkami układu immunologicznego, w tym z makrofagami. Produkty genów cd14, mbl-2,tlr2, tlr4 i slc11a1 regulują funkcje makrofagów, które wydzielając IL-12 oraz TNF-α, stanowią istotne ogniwo pomiędzy mechanizmami komórkowej odporności wrodzonej i nabytej na zakażenia wywoływane przez prątki gruźlicy.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Hoal van Helden EG et al.: Diversity of in vitro cytokine responses by human macrophages to infection by Mycobacterium tuberculosis strains. Cell Biol. Int. 2001; 25: 83-90. 2. Lykouras D: Human genes in TB infection: their role in immune response. Monaldi Arch. Chest Dis. 2008; 69: 24-31. 3. Salgame P: Host innate and Th1 responses and the bacterial factors that control Mycobacterium tuberculosis infection. Curr. Opin. Immunol. 2005; 17: 374-80. 4. Glickman MS, Jacobs WR Jr.: Microbial pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis: dawn of a discipline. Cell 2001; 104: 477-85. 5. Verreck FA et al.: Human IL-23 producing type 1 macrophages promote but IL-10 producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101: 4560-65. 6. van de Vosse E, Hoeve MA: Ottenhoff TH: Human genetics of intracellular infectious diseases: molecular and cellular immunity against mycobacteria and salmonellae. Lancet Infect. Dis. 2004; 4: 739-49. 7. O´Neill LA: How Toll-like receptors signal: what we know and what we don´t know. Curr. Opin. Immunol. 2006; 18: 3-9. 8. van Crevel R, Ottenhoff TH, van der Meer JW: Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbial. Rev. 2002; 15; 294-09. 9. Krutzik SR, Modlin RL: The role of Toll-like receptors in combating mycobacteria. Semin. Immunol. 2004; 16: 35-41. 10. Blackwell JM et al.: Immunogenetics of leishmanial and mycobacterial infection: the Belem family study. Philos Trans. R Soc. Lond B Biol. Sci. 1997; 352: 1331-1345. 11. Bellamy R et al.: Variations in the Nramp1 gene and susceptibility to tuberculosis in West Africans. N. Engl. J. Med., 1998; 338: 640-644. 12. Soborg C et al.: Natural resistance-associated macrophage protein 1 polymorphisms are associated with microscopy-positive tuberculosis. J. Infect. Dis. 2002; 186: 517-21. 13. Greenwood CMT et al.: Linkage of tuberculosis to chromosome 2q35 loci, including Canadian family. Am. J. Hum. Genet. 200067, 405-416. 14. Ryu YJ et al.: Toll-like receptor 2 polymorphisms and nontuberculous mycobacterial lung disease; Clin. Vaccine Immunol. 2006; 13: 818-19. 15. Ogus AC et al.: The Arg753Gln polymorphism of the human Toll-like receptor 2 gene in tuberculosis disease. Eur. Respir. J. 2004; 23: 219-23. 16. Texereau J et al.: The importance of Toll-like receptor 2 polymorphisms in severe infections; Clin. Infect. Dis. 2005; 41: 408-15. 17. van der Graaf CA et al.: Candida-specific interferon-gamma deficiency and toll-like receptor polymorphisms in patients with chronic mucocutaneous candidiasis; Neth. J. Med. 2003; 61: 365-69. 18. Bellamy RB, Hill AV: Genetic susceptibility to mycobacteria and other infectious pathogens in humans. Curr. Opin. Immunol. 1998; 10: 483-487. 19. Mombo LE et al.: Mannose-binding lectin alleles in sub-Saharan Africans and relation with susceptibility to infections; Genes Immun. 2003; 4: 362-67. 20. Selvaraj P, Narayanan PR, Reetha AM: Association of functional mutant homozygotes of the mannose binding protein gene with susceptibility to pulmonary tuberculosis in India. Tuber. Lung Dis. 1999; 79: 221-27. 21. Madsen HO et al.: Interplay between promoter and structural gene variants control basal serum level of mannan-binding protein; J. Immunol. 1995; 155: 3013-20. 22. Druszczyńska M et al.: Tuberculosis bacilli still posing a threat. Polymorphism of genes regulating anti-microbial properties of macrophages. Pol. J. Microbiol. 2006; 55: 7-12. 23. Baldini M et al.: A polymorphism in the 5´ flanking region of the CD14 gene is associated with circulating soluble CD14 levels and with total serum immunoglobulin E. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1999; 20: 976-83. 24. Rosas-Taraco AG et al.: CD14 C(-159)T polymorphism is a risk factor for development of pulmonary tuberculosis; J. Infect. Dis. 2007; 196: 1698-706. 25. Pacheco E et al.: CD14 gene promoter polymorphism in different clinical forms of tuberculosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2004; 40: 207-13. 26. Shutt C: Molecules in focus CD14. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999; 31: 545-49. 27. Joyce DA, Steer JH, Abraham LJ: Glucocorticoid modulation of human monocyte/macrophage function: control of TNF-alpha secretion. Inflamm. Res. 1997; 46: 447-51. 28. Vanham G et al.: Examining a paradox in the pathogenesis of human pulmonary tuberculosis: immune activation and suppression/anergy. Tuber. Lung Dis. 1997; 78: 145-58.
