© Borgis - Nowa Medycyna 2/2009, s. 90-94
*Wiesława Rudnicka, Piotr Szpakowski, Marcin Włodarczyk, Magdalena Kowalewicz-Kulbat, Magdalena Druszczyńska, Marek Fol
Genetyczne i cytokinowe wyznaczniki odpowiedzi na szczepionkę BCG u studentów Uniwersytetu Łódzkiego
Genetic and cytokine markers of immune response to the BCG vaccine in the population of Łódź University
Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Instytut Mikrobiologii Biotechnologii i Immunologii, Uniwersytet Łódzki
Kierownik Katedry: prof. dr hab. Wiesława Rudnicka
Streszczenie
More than 4 billion doses of M. bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) vaccine have been administered worldwide during the last 75 years. However, tuberculosis (TB) remains a significant public-health problem. Immune responses to BCG vaccination in healthy young volunteers were found to be heterogenous and there was significant inter-individual variation.
The BCG vaccination induced the development of DTH to PPD in 82 out off 145 (56% volunteers). The frequency of the CD14-159CC genotype was higher and CD14 – 159CT was lower (43% versus 25% and 46% versus 68%, respectively) in tuberculin-positive than tuberculin-negative volunteers. No association was seen between the skin reactivity to PPD and polymorphisms in the genes encoding NRAMP-1, MBL, IL-10 and TLRs. The levels of mCD14 and sCD14 were not associated with CD14 – 159 polymorphism and the skin reactions to PPD.
A significant reduction in the production of IFN-γ and enhancement in releasing of IL-10 was observed for tuberculin-negative as compared with tuberculin- positive volunteers.
Kiedy w latach 20-tych ubiegłego wieku, w Instytucie Pasteura w Lille, we Francji, Albert Calmette i Camille Guérin opracowali pierwszą i dotąd jedyną dopuszczoną do stosowania u ludzi, szczepionkę przeciwgruźliczą BCG (Bacille Calmette Guérin), wydawało się, że problem gruźlicy i jej skutków klinicznych i społecznych będzie szybko rozwiązany. Dzisiaj, po podaniu dzieciom, w ponad 180 krajach świata, ponad 4 bilionów dawek szczepionki BCG nie możemy potwierdzić spełnienia tych dawnych nadziei. Ochronne właściwości szczepień BCG od początku były różnie oceniane, od 0% w badaniach prowadzonych w Indiach do około 80% w innych obszarach geograficznych (1). Dzisiaj zgodnie przyznaje się, że szczepionka BCG chroni dzieci przed zachorowaniem na gruźlicę, zwłaszcza na najgroźniejsze postacie gruźlicy, jakimi są gruźlica ośrodkowego układu nerwowego i uogólniona gruźlica „prosówka”. U dorosłych, ochronną skuteczność szczepień BCG ocenia się najwyżej na 50% (2, 3). Najlepszym dowodem na niewystarczającą skuteczność ochronną szczepień BCG są najnowsze dane epidemiologiczne gruźlicy (WHO). Jedna trzecia populacji świata zakażona Mycobacteriumtuberculosis. Ponad 14 milionów przypadków gruźlicy rocznie, w tym ponad 9 milionów nowych zachorowań na gruźlicę. Blisko 2 miliony ludzi umiera z powodu gruźlicy każdego roku. Szybko wzrastająca częstość izolowania od chorych, prątków opornych na dwa podstawowe leki przeciwprątkowe, izoniazyd i rimfapicynę (MDR – Multi Drug Resistant) oraz prątków opornych na te dwa leki i dodatkowy/dodatkowe leki przeciwprątkowe (XDR – Extensive Drug Resistant). Szczególnym i częstym problemem epidemiologicznym i klinicznym są ko-infekcje M. tuberculosis i wirusa HIV. Przedstawione dane dowodzą, że gruźlica pozostaje nadal chorobą stanowiącą ogólnoświatowe zagrożenie zdrowotne, i jest jedną spośród 3, obok AIDS i malarii, chorobą najczęstszą powodowaną przez jeden czynnik zakaźny (4). Ten fakt, na szczęście od kilku już lat doceniany przez ekipy rządzące, przemysł farmaceutyczny i biotechnologiczny, sprawia, że w licznych, w tym najbardziej renomowanych ośrodkach naukowych i firmach biotechnologicznych, opracowuje się nowe szczepionki do profilaktyki gruźlicy, z nadzieją, że będą one bardziej skuteczne niż szczepionka BCG. Są to szczepionki nowej generacji, rekombinowane, podjednostkowe do podawania z adiuwantami oraz szczepionki DNA (1, 3, 5, 6, 7).
ODPOWIEDŹ IMMUNOLOGICZNA NA MYKOBAKTERIE
Przebieg zakażenia M. tuberculosis u ludzi jest bardzo zróżnicowany. Na gruźlicę choruje tylko około 5% osób zakażonych prątkami gruźlicy, najczęściej w wieku zaawansowanym, wiele lat po pierwotnym zakażeniu (8). U pozostałych osób dochodzi do trwałego wygaszenia pierwotnych ognisk gruźliczych, jednak bez eradykacji prątków i do utrwalenia się zakażenia latentnego. Za tak zróżnicowany przebieg zakażenia wirulentnymi prątkami M. tuberculosis odpowiadają przede wszystkim odmienne spektra odpowiedzi immunologicznej ludzi na antygeny mykobakerii. Nie odrzucając możliwego udziału zróżnicowanej wirulencji prątków gruźlicy w różnym przebiegu zakażeń M. tuberculosis, w oparciu o współczesną wiedzę należy stwierdzić, że immanentne właściwości systemu odpornościowego i profil oraz nasilenie odpowiedzi immunologicznej, głównie komórkowej, na wirulentne prątki gruźlicy decydują o tym, że zakażona nimi osoba choruje, jest podatna na gruźlicę, lub jest odporna na tę chorobę i nigdy nie ma objawów klinicznych gruźlicy. Przyjmując, że osobnicze zróżnicowanie reakcji immunologicznej na wirulentne prątki M. tuberculosis determinuje podatność lub odporność na gruźlicę, należy założyć, że osobnicze zróżnicowanie odpowiedzi immunologicznej na atentowane bakterie M. bovis BCG wyznacza stan poszczepiennej odporności na chorobotwórcze prątki gruźlicy lub jej brak. Reakcje odpornościowe na prątki BCG zachodzące u szczepionych nimi osób, ich profil i nasilenie, pozostają słabo poznane (9). Pogłębienie wiedzy na ten temat jest niezbędne dla zrozumienia niezadowalającej efektywności ochronnej szczepień BCG. Ponadto, obecnie opracowywane szczepionki przeciwgruźlicze (5) znajdujące się w badaniach przedklinicznych u ludzi, wykorzystują prątki M. bovis BCG dla otrzymywania rekombinantów wzbogaconych w wysoce immunogenne antygeny mykobakterii (7) lub obdarzonych zdolnością przenikania z fagosomów do cytosolu komórkowego i aktywowania cytotoksycznych limfocytów T (3). Lepsze efekty ochronne szczepień BCG stwierdzane u dzieci niż u dorosłych stały się impulsem do przygotowywania szczepionki podjednostkowej zawierającej antygeny wirulentnych bakterii M. tuberculosis, których nie ma w atenuowanych prątkach M. bovis BCG (np. ESAT-6), które wstrzykiwane osobom wcześniej uodpornianym BCG wraz z adiuwantami nowej generacji, odbudowywałyby i przedłużały stan odporności przeciwgruźliczej (6).
POLIMORFIZM GENÓW ISTOTNYCH DLA FUNKCJI KOMÓREK EFEKTOROWYCH W ODPORNOŚCI NA MYKOBAKTERIE
Najważniejszym czynnikiem decydującym o chorobotwórczości mykobakterii jest ich zdolność do przeżywania i namnażania się w mało aktywnych makrofagach. Już we wczesnej fazie reakcji odpornościowej na wnikające lub wprowadzane, jako szczepionka BCG, prątki makrofagi reagują rozpoznając ich konserwatywne wzorce molekularne (Pathogen Associated Molecular Pattern – PAMP). Wynikiem tego jest kaskada sygnałów prowadząca do wydzielania przez makrofagi właściwych cytokin, regulujących interakcje patogenu z układem odpornościowym gospodarza. Receptorami z grupy PAMP zaangażowanymi w rozpoznawanie charakterystycznych struktur powierzchniowych prątków przez makrofagi jest cząsteczka CD14 oraz receptory Toll-podobne (Toll-like Receptor – TLR), głównie TLR2, TLR4 i wewnątrzkomórkowy receptor TLR9. Znany jest polimorfizm tych receptorów u ludzi (10, 11), dlatego w naszych badaniach oceniliśmy częstość polimorfizmu w genach: cd14-159CT, tlr2-Arg677Trp, tlr2-Arg753Gln, tlr4-Asp299Gly, tlr4-Thr399Ile oraztlr9-T1237C, u zdrowych, młodych (do 30 lat) osób, studentów i doktorantów Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego, którzy udokumentowali przebieg szczepień BCG na podstawie książeczek zdrowia. U ochotników uczestniczących w tych badaniach, wykonanych na podstawie zgody Lokalnej Komisji Etyki Badań, wykonano testy tuberkulinowe. Wykazano zróżnicowaną reakcję skórną na śródskórnie wstrzykiwany preparat RT23 tuberkuliny w dawce2 IU, sprawdzaną 3 dnia po wykonaniu testu (tab. 1).
Tabela 1. Średnica skórnej reakcji w testach tuber-kulinowych u zdrowych młodych ochotników szczepio-nych BCG.
| Średnica reakcji skórnej na RT23 (mm) | Liczba |
| Tuberkulinoujemni n=63 |
| 0-5 | 12 |
| 6-9 | 51 |
| Tuberkulinododatni n=82 |
| 10-14 | 61 |
| 15 i powyżej | 21 |
Za dodatni odczyn tuberkulinowy przyjęto reakcję skórną na PPD o średnicy co najmniej 10 mm. Zatem wśród 145 ochotników, szczepienie BCG spowodowało rozwój nadwrażliwości późnej (Delayed Type Hypersensitivity – DTH) na tuberkulinę tylko u 82 (56%) osób. Pozostałe osoby, pomimo otrzymywania 2-5 dawek szczepionki BCG, tuż po urodzeniu i następnie w wieku szkolnym i studenckim, pozostawały tuberkulino ujemne. Świadczy to o zróżnicowanej zdolności dzieci i młodzieży do wytwarzania DTH na białka tuberkulinowe w odpowiedzi na prątki BCG. W naszych badaniach sprawdzono, czy takiemu zróżnicowaniu towarzyszy jakaś różnica w częstości polimorfizmu genów kodujących CD14 i TLRy. O ile rozkład polimorfizmów tlr2-Arg753Gln,tlr4-Asp299Gly, tlr4-Thr399Ile oraz tlr9-T1237C był podobny w grupie ochotników tuberkulino dodatnich i tuberkulino ujemnych to zaobserwowano między tymi grupami różnice w częstości występowania genotypów cd14-159. W grupie ochotników tuberkulino dodatnich, częstość genotypu cd14-159CC i cd14-159CT była wyższa niż w grupie osób tuberkulino ujemnych. Polimorfizm w genie cd14-159 był niezależny od poziomu ekspresji błonowego receptora mCD14 na świeżo izolowanych monocytach oraz stężenia rozpuszczalnej formy receptora sCD14 w surowicy. Poziom obydwu form receptorów u ochotników tuberkulino dodatnich i tuberkulino ujemnych był podobny (12). Na makrofagach stymulowanych PPD lub LPS, ale nie żywymi prątkami BCG, następowało nasilenie ekspresji mCD14, podobne na komórkach otrzymywanych od ochotników tuberkulino ujemnych i tuberkulino dodatnich. Dotychczasowe nasze wyniki nie pozwalają wytłumaczyć roli CD14 w rozwoju nadwrażliwości późnej na tuberkulinę u osób poddawanym szczepieniom BCG. Receptor CD14 uczestniczy w tworzeniu kompleksu lipoarabinomannanu, lipoproteiny 19 kDa mykobakterii i innych lipidowych struktur mykobakterii z receptorami TLR2 i współpracującymi TLR9 oraz receptorami TLR4 na makrofagach (8, 13, 14, 15, 16). Uruchamia to kaskadę sygnałową obejmującą białko adaptorowe MyD88, układ kinaz serynowo-treoninowych i uwolnienie czynnika transkrypcyjnego NFęB. Konsekwencją jest produkcja i uwalnianie przez makrofagi cytokin prozapalnych, między innymi TNF-α i IL-12.
Poziom rozpuszczalnego receptora CD14, który również uczestniczy w grupowaniu receptorów Toll-podobnych na makrofagach i uruchamianiu kaskady sygnałowej w tych komórkach podlegał osobniczej zmienności. Nie stwierdzono znamiennej różnicy w poziomie sCD14 w surowicach ochotników tuberkulino dodatnich (250-3180 ng/ml; średnio 1533 ng/ml) i tuberkulino ujemnych (460-2092 ng/ml; średnio 1461 ng/ml). Podobnie nie wykazano różnicy w nasileniu ekspresji błonowego mCD14 na świeżo izolowanych monocytach ochotników obu grup.
Makrofagowym białkiem, któremu przypisuje się znaczenie w odporności na wewnątrzkomórkowe patogeny, w tym na mykobakterie, jest NRAMP-1 (natural resistance associated macrophage protein-1) ostatnio nazywane Slc11a1 (solute carrier 11a1 protein) (17). Zwraca się uwagę na znaczenie tego białka w podwyższaniu prozapalnej aktywności makrofagów wyrażającej się nasiloną ekspresją cząsteczek MHC, produkcją chemokin, interleukiny- 1β TNF-α, tlenku azotu oraz wybuchem tlenowym. NRAMP-1 jest zależnym od pH transporterem dwuwartościowych kationów. Podczas fagocytozy, NRAMP jest rekrutowany do błon fagolizosomów, gdzie pośredniczy w transporcie jonów magnezu, żelaza, kobaltu i cynku i sprzyja dojrzewaniu fagosomów, który to proces jest hamowany przez wirulentne mykobakterie (18). Polimorfizmy w genie NRAMP-1 opisywano, jako czynniki zachorowania lub przeciwnie odporności na gruźlicę. W naszych badaniach oceniliśmy częstość polimorfizmu genu NRAMP-1 w intronie 4 polegającym na substytucji G/C (INT4 G/C), u zdrowych młodych osób szczepionych BCG. Rozkład alleli i genotypów tego genu był podobny w grupie ochotników tuberkulino dodatnich i tuberkulino ujemnych, wykluczając związek tego polimorfizmu z wytwarzaniem DTH na tuberkulinę w odpowiedzi na szczepienia BCG.
W interakcji mykobakterii z makrofagami istotne znaczenie należy przypisać lektynie wiążącej mannozę – MBL (mannose binding lectin) (19). Lektyna ta wiążąc się do reszt mannozy, na powierzchni mykobakterii, aktywuje dopełniacz, którego aktywne składniki odnajdują receptory dla dopełniacza na makrofagach, ułatwiając wnikanie mykobakterii do tych komórek. Związanie MBL do reszt mannozy na powierzchni mykobakterii ułatwia również ich pochłanianie z wykorzystaniem makrofagowych receptorów mannozowych. Poziom MBL w surowicy determinowany jest fenotypowym wariantem genu mbl-2 (19). Osoby z fenotypem aa mbl-2posiadają znacząco więcej MBL w surowicy (w naszych badaniach, średnio 1094 i 1432 ng/ml, odpowiednio w grupie ochotników tuberkulino dodatnich i tuberkulino ujemnych) niż osoby z fenotypem ab, ac, ad, bb lub bd (w naszych badaniach, średnio 341 i 427 ng/ml, odpowiednio w grupie tuberkulino dodatniej i tuberkulino ujemnej). Nie zaobserwowaliśmy statystycznie znamiennej różnicy w poziomie MBL w surowicach ochotników z dodatnią i ujemną reakcją skórną na PPD i odpowiadającym wariantem fenotypowym genu mbl-2.
Profil i nasilenie adaptacyjnej odporności na drobnoustroje i ich antygenowe struktury pełni interleukina-10. U ludzi, gen IL-10 wykazuje polimorfizm (20). Interesującym było sprawdzenie, czy rozwój lub brak rozwoju DTH na PPD u osób szczepionych BCG pozostawał w związku z polimorfizmem genu IL-10. Zanotowane różnice częstości występowania alleli i genotypów genu IL-10-1082 A/G pomiędzy ochotnikami tuberkulino dodatnimi i tuberkulino ujemnymi nie były znamienne statystycznie.
ROLA CYTOKIN W ODPORNOŚCI NA MYKOBAKTERIE
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Mustafa A.S. Development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis. Mol. Immunol. 2002; 39: 113-119. 2. MittrŘcker H-W. et al. Poor correlation between BCG vaccination-induced T cell responses and protection against tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007; 104: 12434-12439. 3. Reece ST and Kaufmann SH. Rational design of vaccines against tuberculosis directed by basic immunology. Int. J. Med. Microbiol. 2008;298:143-150. 4. WHO Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Finansing. WHO Report 2004. Geneva, Switzerland. 5. Rudnicka W i Rudnicka K. 60 lat szczepień BCG. Osiągnięcia, przegrane i nadzieje - nowe szczepionki przeciwgručlicze w programach klinicznych. Post. Mikrob. 2008;47:379-385. 6. Agger EM et al. Protective immunity to tuberculosis with Ag85B-ESAT-6 in synthetic cationic adiuvant system IC31. Vaccine. 2006;24:54-52. 7. Hawkridge T et al. Safety and immunoigenicity of a new tuberculosis vaccine, MVA85A, in healthy adults in South Africa. J. Infect. Dis. 2008;15:544-552. 8. Rudnicka W. Molekularne mechanizmy odporności na gručlicę. Post. Mikrobiol. 2004; 43: 107-127. 9. Finan C. et al. Natural variation in immune responses to neonatal Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin (BCG) vaccination in a cohort of Gambian infants. PLOS ONE. 2008; 3: e3485. 10. Takeda K and Akira S. Toll-like receptors in innate immunity. Int. Immunol. 2005;17:1-14. 11. Reiling N. et al. Cutting edge: Toll-like receptor (TLR)2- and TLR4- mediated pathogen recognition in resistance to airborne infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 2002; 169: 3480-3484. 12. Strapagiel D et al. Monocyte response receptors in BCG driven delayed type hypersensitivity to tuberculin. Folia Histochem. Cytobiol. 2008;46:353-359. 13. Druszczyńska M. et al. Tuberculosis bacilli still posing a threat. Polymorphism of genes regulating anti-mycobacterial properties of macrophages. Pol. J. Microbiol. 2006; 55: 7-12. 14. Pacheco E. et al. CD14 gene promoter polymorphism in different forms of tuberculosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2004; 40:207-213. 15. Rosas-Taraco A.G. et al. CD14 C(-159)T polymorphism is a risk factor for development of pulmonary tuberculosis. J Infect. Dis. 2007; 196: 1698-1706. 16. Athman R., Philpott D. Innate immunity via Toll-like receptors and Nod Proteins. Curr. Opin. Microbiol. 2004; 7: 25-32. 17. North R.J. et al. Significance of antimycobacterial gene, Nramp1, in resistance to virulent Mycobacterium tuberculosis infection. Res. Immunol. 1996;147:493-499. 18. Gomez MA, Li S, Tremblay ML, Olivier M. NRAMP-1 expression modulate protein-tyrosine phosphate activity In macrophages. Impact on host cell signalling and function. J. Biol. Chem. 282, 2007, 36190-36198. 19. Selvaraj P. Et al. Role of mannose binding lectin gene variants on its protein levels and macrophage phagocytosis with live Mycobacterium tuberculosis in pulmonary tuberculosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006;46:433-437. 20. Awomoyi A. Et al. Interleukin-10 polymorphism in SLC11A1 and susceptibility to tuberculosis. J. Infect. Dis. 2002; 186: 1808-1814. 21. Stenger S. Immunological control of tuberculosis: role of tumour necrosis factor and more. Ann. Rheum. Dis. 2005; 64: 24-28. 22. Biet F. et al. Mycobacterium bovis BCG producing IL-18 increases antigen-specific gamma interferon production in mice. Infect. Immun. 2002; 70: 6549-6557. 23. Gracie J.A. et al. Interleukin-18. J. Leukoc. Biol. 2003; 73: 213-224. 24. Tominaga K. et al. IL-12 synergizes with IL-18 or IL-1b for IFN-γ production from human T cells. Intern. Immunol. 2000; 12: 151-160. 25. Paziak-Domańska B. et al. The lack of relationship between serum content of MBL, sCD14, anti-PPD and anti-Hsp65 IgG and ingestion of Mycobacterium bovis BCG bacilli by phagocytes. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2002; 50: 337-344. 26. Kowalewicz - Kulbat M et al. Naive helper T cells from BCG-vaccinated volunteers produce IFN-γ and IL-5 to mycobacterial antigen-pulsed dendritic cells. Folia Histochem. Cytobiol. 2008; 46: 5-9.
