© Borgis - Nowa Stomatologia 1/2003, s. 44-48
Ewa Grabowska1, Renata Górska2, Katarzyna Charazińska-Carewicz2
Zależność pomiędzy polimorfizmem (A+49G) w obrębie pierwszego egzonu genu dla CTLA-4, a występowaniem i fenotypem liszaja płaskiego
Association of the (A+49G) exon 1 CTLA-4 gene polymorphism with oral lichen planus prevalence and phenotype
1 staż podyplomowy w Zakładzie Chorób Błony Śluzowej i Przyzębia Instytutu Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie
2 z Zakładu Chorób Błony Śluzowej i Przyzębia Instytutu Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Renata Górska
Wstęp
Liszaj płaski jest chorobą autoimmunologiczną o przewlekłym przebiegu, dotyczącą błon śluzowych oraz skóry. W patogenezie liszaja zasadniczą rolę odgrywają limfocyty T i ich reakcja skierowana przeciwko keratynocytom warstwy podstawnej nabłonka (1, 2).
Uważa się obecnie, że czynniki zewnętrzne, takie jak przyjmowane leki lub materiały stomatologiczne, powodują zmianę antygenów powierzchniowych keratynocytów oraz ekspresję cząsteczek układu MHC klasy II. Komórki Langerhansa oraz komórki dendrytyczne prezentują limfocytom T zmienione białka w połączeniu z peptydami MHC. Na skutek ekspresji cytokin i czynników chemotaktycznych liczne limfocyty T oraz B migrują do nabłonka. Rozwija się specyficzna odpowiedź immunologiczna skierowana przeciwko komórkom posiadającym rozpoznawane antygeny na swej powierzchni. W rezultacie keratynocyty są niszczone przez limfocyty cytotoksyczne T (1, 3, 4, 5, 6).
Jednak nie u wszystkich osób narażonych na działanie tych samych związków chemicznych dochodzi do rozwoju choroby. Sugeruje to istnienie osobniczej podatności na choroby autoimmunologiczne. Stosunkowo częste rodzinne występowanie niektórych z nich skłania do rozważenia genetycznego podłoża tej podatności (7).
Początkowo badania nad genetycznie uwarunkowaną skłonnością do chorób autoimmunologicznych skupiały się na obszarze kodującym białka układu HLA. Dla wielu schorzeń, w tym między innymi dla liszaja płaskiego, udało się wyodrębnić genotypy sprzyjające jak i zapobiegające rozwojowi choroby (4, 8).
Dalsze badania wykorzystujące zjawisko niezrównoważenia sprzężeń oraz prowadzone na spokrewnionych chorych sugerowały, że obszarem genomu odpowiedzialnym za zwiększone ryzyko niektórych chorób autoimmunologicznych jest rejon 2q33. W obszarze tym leżą między innymi geny dla białek CD28 oraz CTLA-4 (7, 9, 10).
CD28 i CTLA-4 to białka błonowe, które uczestniczą w kontroli aktywacji limfocytów T. CD28 obecne jest na powierzchni większości spoczynkowych limfocytów T CD4+ i części limfocytów CD8+, podczas gdy CTLA-4 pojawia się na tych samych komórkach po aktywacji limfocytu (8, 11, 12).
CD28 dostarcza sygnału kostymulującego, niezbędnego w procesie pobudzenia limfocytów T (7, 8). Receptor CTLA-4 uważany jest za jeden z głównych inhibitorów aktywacji limfocytów (11). Stwierdzono, że pobudzenie receptora CTLA-4 prowadzi do zahamowania proliferacji limfocytów T i wprowadzenia w stan anergii, a nawet ich apoptozy, zmniejszenia ekspresji receptora dla Il-2 oraz zahamowania wydzielania cytokin (8, 11, 13).
U myszy pozbawionych genu dla CTLA-4 stwierdzano aktywację poliklonalną limfocytów T, co prowadziło do choroby limfoproliferacyjnej i śmierci w ciągu 3-4 tygodni (14). Stwierdzono również, że zablokowanie CTLA-4 u zdrowych myszy nasila proliferację limfocytów T i prowadzi do rozwinięcia się u nich chorób autoimmunologicznych (15).
Znane są trzy rejony polimorficzne w genie dla CTLA-4: polimorfizm w egzonie 1 (alanina/guanina w pozycji 49), polimorfizm mikrosatelitarny (zawierający powtórzenia AT, nie ulegający translacji odcinek 3´ egzonu 3) i polimorfizm w obrębie promotora (cytozyna/tymina w pozycji –318) (7, 16).
Mutacja A(r)G w pozycji +49 egzonu 1, której efektem jest zamiana aminokwasu (Thr(r)Ala), powoduje ekspresję niepełnowartościowego receptora. W rezultacie hamowanie aktywacji limfocytów T jest upośledzone. Stwierdzono, że limfocyty osób o genotypie GG wykazują bardziej nasiloną proliferację pod wpływem różnych czynników w stosunku do limfocytów od osób o genotypie AA (17). Występowanie genotypu GG w połączeniu z odpowiednimi genami układu HLA uważane jest za istotny czynnik ryzyka wystąpienia chorób autoimmunologicznych (17, 18).
Potwierdzono związek między genotypem GG w egzonie 1 genu dla CTLA-4, a występowaniem choroby Gravesa (GD), choroby Hashimoto (HT), cukrzycy insulinozależnej (IDDM), stwardnienia rozsianego, reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Addisona czy tocznia rumieniowatego wielopostaciowego (10, 19, 20). W przypadku choroby Gravesa gen dla CTLA-4 uważany jest wręcz obecnie za najważniejszy z genetycznych czynników ryzyka (major Graves´ disease locus). Ponadto genotyp GG u tych chorych wiąże się z większym ryzykiem wystąpienia TAO (thyroid-associated orbitopathy) i cięższym jej przebiegiem (21).
Pod względem etiopatogenezy, obrazu klinicznego i histopatologicznego liszaj płaski porównywany jest również do nadwrażliwości typu późnego (typ IV) oraz choroby graft-versus-host (4, 22).
Reakcja nadwrażliwości typu późnego także zależna jest od limfocytów T. Antygenem są białka związane z różnymi związkami drobnocząsteczkowymi. Uczulenie powstaje na skutek długotrwałej ekspozycji na te związki. Kompleksy złożone z antygenu, białka i cząsteczki układu MHC prezentowane są limfocytom T pomocniczym, prowadząc do ich aktywacji (22). Stwierdzono, że obecność sprawnie działającego CTLA-4 hamuje reakcję nadwrażliwości, natomiast obecność niepełnowartościowego receptora sprzyja jej powstawaniu.
W przebiegu choroby graft-versus-host limfocyty dawcy narządu zwracają się przeciwko komórkom biorcy. Udowodniono, że pobudzanie prawidłowo działającego receptora CTLA-4 może zapobiec lub cofnąć wystąpienie GvHD – wprowadzając limfocyty w stan anergii (6, 23).
W literaturze nie opisywano dotychczas badań dotyczących związku pomiędzy polimorfizmem genu dla CTLA-4 w pozycji 49 w egzonie 1 a występowaniem OLP. Jedynie Alaibac (9) donosi o zwiększonej ekspresji CTLA-4 w limfocytach osób chorych na LP w porównaniu do innych chorób zapalnych i nowotworowych skóry. Takie zwiększenie ekspresji może być skutkiem upośledzonej funkcji receptora – hamowanie aktywacji limfocytów T jest nieskuteczne, co zwrotnie prowadzi do nasilenia ekspresji CTLA-4 (9).
Drouet i wsp. (24) oceniali zależność pomiędzy polimorfizmem w 1 egzonie genu dla CTLA-4 oraz występowaniem pemfigoidu błon śluzowych i pemfigoidu bliznowaciejącego. Nie stwierdzili istotnego statystycznie związku, jakkolwiek nie udało im się go również wykluczyć. Należy jednak zaznaczyć, że w patogenezie liszaja płaskiego, podobnie jak choroby GvHD czy nadwrażliwości typu IV, dominujące znaczenie ma komórkowa odpowiedź immunologiczna, podczas gdy w pemfigoidzie jest to odpowiedź humoralna.
Opierając się na wymienionych wynikach badań doświadczalnych można przypuszczać, że allel G, związany ze zmniejszoną kontrolą proliferacji limfocytów T, może mieć znaczenie w patogenezie OLP, podobnie jak ma to miejsce w innych chorobach autoimmunologicznych.
Cel pracy
Celem pracy było zbadanie zależności między polimorfizmem A(+49)G w obrębie pierwszego egzonu genu dla CTLA-4, wpływającym na fenotyp i aktywność receptora CTLA-4, a występowaniem i przebiegiem liszaja płaskiego.
Materiał i metody
Badanie podmiotowe i przedmiotowe przeprowadzono w Zakładzie Chorób Błony Śluzowej i Przyzębia Instytutu Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie.
Do grupy badanej zakwalifikowano 30 osób (26 kobiet i 4 mężczyzn) z liszajem płaskim Wilsona, w wieku 44-86 lat (średnio 63,2). Rozpoznanie wstępne stawiano na podstawie obrazu klinicznego, a w wątpliwych przypadkach potwierdzano badaniem histopatologicznym.
Grupę kontrolną stanowiło 30 zdrowych, niespokrewnionych dawców krwi (25 kobiet i 5 mężczyzn), w wieku 25-64 lat (średnio 45,1).
Badanie podmiotowe
Badanie podmiotowe obejmowało między innymi dotychczasowy przebieg choroby, dolegliwości subiektywne oraz stosowane leczenie i jego skuteczność, współistnienie chorób ogólnych, przyjmowane leki, narażenie na stres. Dla ustalenia genetycznej podatności na choroby autoimmunologiczne zwracano uwagę na występowanie tych chorób u osób spokrewnionych.
Badanie przedmiotowe
W badaniu klinicznym oceniano postać liszaja płaskiego zgodnie z uproszczoną klasyfikacją według Bagan-Sebastian (25). Klasyfikacja ta uwzględnia dwie postacie liszaja – siateczkową (lichen planus reticularis), charakteryzującą się obecnością zmian o charakterze grudek, oraz zanikowo-nadżerkową (lichen planus atrophic-erosivus), w której mogą występować nadżerki i ścieńczenia nabłonka. Do grupy S (postać siateczkowa) zaliczano wyłącznie osoby, u których nigdy nie występowały zmiany inne niż grudki, natomiast do grupy N (postać zanikowo-nadżerkowa) tych chorych, u których w momencie badania lub kiedykolwiek w wywiadzie obecne były nadżerki, zanik nabłonka jamy ustnej lub złuszczające zapalenie dziąseł.
Oceniano także obecność czynników urazowych – mechanicznych (uraz zgryzowy, uzupełnienia protetyczne) lub chemicznych (wypełnienia amalgamatowe) i ich korelację z lokalizacją zmian.
W badaniu zewnątrzustnym poszukiwano zmian w obrębie skóry i na paznokciach.
Oznaczanie polimorfizmu genu dla CTLA-4
W celu uzyskania DNA do analizy genetycznej do probówek z EDTA pobierano 2 mL krwi obwodowej. Materiał zamrażano w -20oC i przechowywano do dalszej analizy. Izolacji z krwi i oczyszczenia DNA dokonywano za pomocą zestawu QIAamp(r)DNA Kit. Stężenie i czystość uzyskanego DNA mierzono metodą spektrofotometryczną.
Oznaczanie polimorfizmu A(+49)G w obrębie pierwszego egzonu genu dla CTLA-4 rozpoczynano od namnożenia fragmentu pierwszego egzonu genu dla CTLA-4 za pomocą PCR, przy użyciu oligonukleotydów startowych 5´-cca cgg ctt cct ttc tcg ta-3´ i 5´-agt ctc act cac ctt tgc ag-3 (21). Produkt reakcji oceniano na 2% żelu agarozowym. Próbki poddawano następnie trawieniu enzymem restrykcyjnym Bst71I. Produkt reakcji ponownie oceniano na 2% żelu agarozowym i na podstawie analizy RFLP prowadzono genotypowanie.
Badania genetyczne przeprowadzone zostały w Pracowni Biologii Molekularnej Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych i Nadciśnienia Tętniczego Akademii Medycznej w Warszawie.
Analiza statystyczna
Oceniano, czy allele w badanych populacjach rozmieszczone są zgodnie z równowagą Hardy-Weinberga. Dane ilościowe analizowano przy użyciu testu t-Studenta, natomiast dane jakościowe testem χ2, za znamienne statystycznie przyjmując p < 0,05, za wyznacznik tendencji p < 0,1.
Wyniki
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Eversole L.: Immunopathogenesis of oral lichen planus and recurrent aphthous stomatitis. Sem. Cutan. Med. Surg., 1997, 16 (4):284-94. 2. Hejniak B. i wsp.: Współczesne poglądy na etiopatogenezę i leczenie liszaja płaskiego Wilsona. Klinika 1998, 5(7):733-37. 3. Porter S.R. et al: Immunologic aspects of dermal and oral lichen planus. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol., 1997, 83:358-66. 4. Charazińska-Carewicz K.: Współczesne poglądy na liszaj płaski. Stomat. Współczesna 1995, 2 (5):430-35. 5. Sugerman et al.: Autocytotoxic T-cell clones in lichen planus. Brit. J. Dermatol., 2000, 142:449-456. 6. Hasseus B. et al: Langerhans cells and T cells in oral graft versus host disease and oral lichen planus. Scand. J. Immunol., 2001, 54:516-24. 7. Yanagawa T. et al.: CTLA-4 gene polymorphism associated with Graves´disease in a Caucasian population. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1995, 80:41-45. 8. Craig et al.: The emerging role of CTLA-4 as an immune attenuator. Immunity 1997, 7:445-450. 9. Alaibac M. et al.: In situ expression of the CTLA-4 receptor in T-cell-mediated inflammatory and neoplastic skin diseases. Arch. Dermatol. Res., 2000, 292: 472-74. 10. Tomer Y. et al: CTLA-4 and not CD28 is a susceptibility gene for thyroid autoantibody production. J. Clin. Endocr. Metab., 2001, 86 (4): 1687-93. 11. Pistillo M.P. et al.: Anti-CTLA-4 Human scFv antibodies prevent T-cell activation in transplantation. Transpl. Proceed., 2001, 33: 285-87. 12. Alegre et al.: Regulation of surface and intracellular expresion of CTLA-4 on mouse T cells. J. Immunol., 1996, 157:4762-70. 13. Epstein et al.: Costimulatory B7 molecules in the pathogenesis of infectious and autoimmune diseases. N. Engl. J. Med., 1996, 335:1369-77. 14. Waterhouse et al.: Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in CTLA-4. Science 1995, 270:985-88. 15. Takahashi et al.: Immunologic self-tolerance maintained by CD25+ CD4+ regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med., 2000, 192(2):303-309. 16. Braun et al.: CTLA-4 promoter variants in patients with Graves´ disease and Hashimoto´s thyroiditis. Tissue Antigens 1998, 51:563-566. 17. Kouki et al.: CTLA-4 gene polymorphism at position 49 in exon 1 reduces the inhibitory function of CTLA-4 and contributes to the pathogenesis of Graves´ disease. J. Immunol., 2000, 165:6606-6611. 18. Osei-Hyiaman D. et al: Association of a novel point mutation (C159G) of the CTLA4 gene with type 1 diabetes in West Africans but not in Chinese. Diabetes 2001, 50:2169-71. 19. Donner et al.: CTLA-4 alanine-17 confers genetic susceptibility to Graves´ disease and to type 1 diabetes mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1997, 82:143-146. 20. Donner et al.: Codon 17 polymorphism of the CTLA-4 gene in Hashimoto´s thyroiditis and Addison´s disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1997, 83:4130-32. 21. Vaidya B. et al.: Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) gene polymorphism confers susceptibility to thyroid associated orbitopathy. Lancet 1999, 354:743-44. 22. Krasowska D: Liszaj płaski. Nowa Medycyna, 107:21-24. 23. Yu et al.: CD28-specific antibody prevents graft-versus-host disease in mice. J. Immunol., 2000, 164(9):4564-68. 24. Drouet et al.: CTLA4 exon 1 dimorphism in bullous and cicatricial pemphigoid. Eur. J. Immunogenet 2000, 27(2):77-79. 25. Bagan-Sebastian et al.: A clinical study of 205 patients with oral lichen planus. J. Oral Maxillofac. Surg., 1992. 50(2):116-118. 26. Wysocki J. i wsp.: Badania immunologiczne u chorych na liszaj płaski (LP). Nowa Stomatologia 1997, 2(3):18-22.
