© Borgis - Nowa Stomatologia 4/2003, s. 163-167
Małgorzata Pleszczyńska1, Adrian Wiater1, Janusz Szczodrak1, Teresa Bachanek2
Poszukiwanie naturalnych inhibitorów aktywności glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych
Searching for natural substances inhibiting glucosyltransferases from mutans streptococci
1 z Zakładu Mikrobiologii Przemysłowej, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Janusz Szczodrak
2 z Katedry i Zakładu Stomatologii Zachowawczej Akademii Medycznej w Lublinie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Teresa Bachanek
Próchnica zębów jest wypadkową wielu zjawisk, jednak podstawowe znaczenie ma w tym procesie płytka nazębna, czyli skupisko bakterii pokrywających powierzchnię zęba, osadzonych w podłożu zbudowanym z polimerów pochodzenia bakteryjnego lub ślinowego. Z całej gamy mikroorganizmów zasiedlających jamę ustną, najbardziej zaangażowane w wywoływanie i rozwój próchnicy zębów są paciorkowce zmienne, głównie Streptococcus mutans i S. sobrinus (1). Ich szczególne znaczenie w patogenezie próchnicy wynika z faktu, że wykorzystując sacharozę wytwarzają zewnątrzkomórkowe, rozpuszczalne i nierozpuszczalne w wodzie wielocukry (dekstrany i mutany), budujące szkielet płytki nazębnej. Enzymy biorące udział w syntezie wymienionych glukanów – glukozylotransferazy (GTF, E.C. 2.4.1.5) są więc istotnym czynnikiem wirulencji paciorkowców zmiennych (2). Funkcje glukanów w płytce nazębnej wyznacza ich budowa. Lepki, nierozpuszczalny mutan (liniowy a(1,3) glukan) ułatwia adsorbowanie się bakterii do powierzchni szkliwa, doprowadza do wytworzenia stabilnego połączenia pomiędzy paciorkowcami a błoną nazębną, a także umożliwia agregację bakterii występujących w niezależnych łańcuchach. W ten sposób odpowiada za zwiększenie masy płytki i jej ścisłe połączenie ze szkliwem (3). Rozpuszczalny dekstran (rozgałęziony a(1,6) glukan) stanowi rezerwę węglowodanową dla dalszych przemian metabolicznych w sytuacji niedoboru cukru w pożywieniu (4).
W praktyce stosowane są różne czynniki hamujące rozwój płytki nazębnej. Działają one poprzez redukcję istniejącej płytki, ochronę przed powstawaniem nowej, selektywne hamowanie wzrostu bakterii próchnicotwórczych i hamowanie czynników wirulencji, np. produkcji kwasu mlekowego i syntezy glukanów (5). Mogą to być zarówno środki chemiczne, np. chlorheksydyna, jak i – w ostatnich latach znowu coraz szerzej wykorzystywane – preparaty naturalne, np. wyciągi roślinne.
Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu wybranych surowców zielarskich na aktywność glukozylotransferaz paciorkowców zmiennych.
MATERIAŁ I METODY BADAŃ
Do badań użyto dwóch szczepów paciorkowców zmiennych, Streptococcus sobrinus DSMZ 20381 i Streptococcus mutans CAPM 6067. Hodowano je na podłożu płynnym z wyciągiem mózgowo-sercowym – BHI (BTL, Polska) w warunkach statycznych i w temperaturze 37°C, przez okres 18 godz. Po zakończeniu hodowli bakterie usuwano przez wirowanie, a uzyskany supernatant, w postaci pierwotnej lub zagęszczony na drodze ultrafiltracji, służył jako surowy preparat zewnątrzkomórkowych glukozylotransferaz.
Zbadano jaki wpływ na aktywność GTF-az mają następujące surowce zielarskie: ziele jemioły, skrzypu, glistnika, liść pokrzywy, porzeczki czarnej, orzecha włos-
kiego, kłącze pięciornika, korzeń mydlnicy lekarskiej
(Zakład Zielarski „Kawon-Hurt”, Gostyń), kora dębu, owoc dzikiej róży, kłącze tataraku, korzeń prawoślazu lekarskiego, liść szałwii i mięty pieprzowej, ziele macierzanki i tymianku (Zakład Przetwórstwa Zielarskiego „Herba-Lux”, Warszawa). Wymienione zioła zastosowano w postaci 4% wyciągu wodnego, a kłącze pięciornika dodatkowo w postaci liofilizowanego ekstraktu etanolowo-wodnego. Dla porównania jako inhibitora enzymów użyto również kwasu elagowego (Sigma-Aldrich, USA) w postaci dwóch pochodnych, sodowej i argininowej, które w przeciwieństwie do związku wyjściowego dobrze rozpuszczają się w wodzie (6).
Do oceny wpływu badanych substancji na ogólną aktywność glukozylotransferaz wykorzystano metodę opisaną przez Smitha i wsp. (7). Mieszaninę reagującą zawierającą 0,9 ml 0,25 M sacharozy w 0,2 M buforze potasowo-fosforanowym o pH 6,0, surowy preparat GTF-az, inhibitor w odpowiednim stężeniu oraz bufor fosforanowy w uzupełnieniu do całkowitej objętości 2 ml, inkubowano w temperaturze 37°C w czasie 60 minut. Po tym czasie, wobec odpowiednich kontroli, oznaczano stężenie cukrów redukujących metodą kolorymetryczną z odczynnikiem DNS (8). Jednostkę aktywności GTF-az (U) definiowano jako 1 mmol fruktozy uwolniony przez enzym z sacharozy w opisanych warunkach w czasie jednej minuty.
Zbadano również oddziaływanie ziół na aktywność enzymów odpowiedzialnych za syntezę nierozpuszczalnego w wodzie mutanu. Wykonano w tym celu oznaczenia turbidymetryczne (9): mieszanina reagująca zawierała 1 ml niezagęszczonego preparatu glukozylotransferaz S. sobrinus, 2 ml 6% roztworu sacharozy w 0,1 M buforze potasowo-fosforanowym o pH 6,0, odpowiednią ilość inhibitora (ekstrakt z pięciornika lub pochodne kwasu elagowego) oraz bufor w uzupełnieniu do całkowitej objętości 4 ml. Jako środek konserwujący zastosowano azydek sodu w stężeniu 0,01%. Mieszaninę inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji, zmętnienie utworzone przez powstający glukan mierzono wobec właściwych kontroli w spektrofotometrze (Cecil, Wielka Brytania) przy długości fali 560 nm.
Wpływ inhibitora na właściwości adhezyjne nierozpuszczalnego w wodzie mutanu określano prowadząc syntezę tego biopolimeru w probówkach zawierających 10 ml niezagęszczonego surowego preparatu glukozylotransferaz S. sobrinus z dodatkiem 3% sacharozy i 0,01% NaN3 oraz z odpowiednią ilością inhibitora. W probówkach zanurzano płytki szklane o szerokości 5 mm i inkubowano je 24 godziny w temperaturze 37°C. Po tym czasie płytki wyjmowano, opłukiwano delikatnie w wodzie, a następnie barwiono osadzony na nich mutan roztworem erytrozyny. Intensywność zabarwienia, która odpowiadała ilości przyczepionego do płytek mutanu mierzono spektrofotometrycznie wobec właściwych kontroli.
Analizy wykonywano w trzech powtórzeniach. Zamieszczone wyniki stanowią średnią z wszystkich pomiarów. Procent zahamowania aktywności GTF-az i aktywność względną tych enzymów wyrażano w stosunku do kontroli bez inhibitora.
WYNIKI
W pierwszym etapie badań oceniono wpływ wyciągów wodnych z osiemnastu ziół na ogólną aktywność glukozylotransferaz dwóch szczepów Streptococcus. W tym celu aktywność enzymów oznaczano w obecności potencjalnych inhibitorów. Obniżenie aktywności GTF-az w stosunku do kontroli bez inhibitora zaobserwowano tylko w przypadku pięciu ziół: róży, porzeczki czarnej, tataraku, orzecha włoskiego i pięciornika kurze ziele (tab. 1). Najsilniej hamował ogólną aktywność GTF-az obu szczepów wodny wyciąg z kłącza pięciornika, przy czym wraz ze wzrostem zawartości inhibitora, w przedziale od 2,5 do 10 mg/ml, ilość glukanów syntetyzowanych przez glukozylotransferazy bakterii spadała stopniowo aż do poziomu około 80% (ryc. 1).
Tabela 1. Wpływ wyciągów wodnych z ziół na ogólną aktywność glukozylotransferaz badanych szczepów paciorkowców zmiennych.
| Inhibitor | Aktywność ogólna glukozylotransferaz |
| S. mutans 6067 | S. sobrinus 20381 |
| (U/ml) | Względna(%) | Hamowanie(%) | (U/ml) | Względna(%) | Hamowanie(%) |
| Brak | 0,9491 | 100,0 | 0 | 0,0748 | 100,0 | 0 |
| Róża | 0,8588 | 90,5 | 9,5 | 0,0707 | 94,5 | 5,5 |
| Porzeczka czarna | 0,7170 | 75,5 | 24,5 | 0,0629 | 84,1 | 15,9 |
| Orzech włoski | 0,8098 | 85,3 | 14,7 | 0,0660 | 88,3 | 11,7 |
| Tatarak | 1,0135 | 106,8 | - | 0,0557 | 74,5 | 25,5 |
| Pięciornik | 0,1728 | 18,2 | 81,8 | 0,0179 | 23,9 | 76,1 |
Ryc. 1. Wpływ wyciągu wodnego z pięciornika na ogólną aktywność glukozylotransferaz badanych szczepów paciorkowców zmiennych.
Biorąc pod uwagę fakt, że zdolność ekstraktu z pięciornika do hamowania ogólnej aktywności GTF-az była o wiele większa niż w przypadku pozostałych ziół, dalsze badania dotyczyły określenia wpływu tylko tego inhibitora na aktywność GTF-az odpowiedzialnych za syntezę nierozpuszczalnego glukanu oraz na przyczepność syntetyzowanego przez nie polimeru. W celu lepszego wyługowania substancji czynnych zawartych w kłączu pięciornika przygotowano w tym wariancie doświadczeń jego ekstrakt etanolowo-wodny i zastosowano go w miejsce używanego dotychczas wyciągu wodnego. Źródłem glukozylotransferaz syntetyzujących nierozpuszczalny w wodzie mutan był płyn po hodowli S. sobrinus, który to szczep uwalnia wspomniane GTF-azy do podłoża, w przeciwieństwie do S. mutans, gdzie są one związane z powierzchnią komórki i przez to trudniejsze do preparowania (10, 11).
Jak widać z przedstawionych danych, liofilizat ekstraktu etanolowo-wodnego z kłącza pięciornika już w stężeniu 320 mg/L powodował około 60% spadek aktywności GTF-az odpowiedzialnych za syntezę mutanu. Ponadto wykazano, że przy tym stężeniu obecność substancji zawartych w ekstrakcie w środowisku, w którym zachodzi synteza glukanu, powoduje prawie całkowitą utratę właściwości adhezyjnych polimeru.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Marsh P.D., Martin M.: Mikrobiologia jamy ustnej. Warszawa: PWN; 1994. 2. Fujiwara T. et al.: Molecular analyses of glucosyltransferase genes among strains of S. mutans. FEMS Microbiol Lett 1998; 161:331-6. 3. Jańczuk Z.: Stomatologia zachowawcza. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL; 1999. 4. Ebisu S. et al.: The structure of water-insoluble glucans of cariogenic S. mutans formed in the absence and presence of dextranase. Carbohydr Res 1974; 38:374-81. 5. Marsh P.D.: Microbiological aspects of the chemical control of plaque and gingivitis. J Dent Res 1992; 71:1431-8. 6. Sawamura S. et al.: Inhibitory effects of ellagic acid on glucosyltransferases from mutans streptococci. Biosci Biotech Biochem 1992; 56:766-8. 7. Smith D.J. et al.: Preparation of glucosyltransferase from Streptococcus mutans by elution from water-insoluble polysaccharide with a dissociating solvent. Infect Immun 1979; 23:446-52. 8. Miller G.L.: Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem 1959; 31:426-8. 9. Kuramitsu H., Wondrack L.: Insoluble glucan synthesis by Streptococcus mutans serotype c strains. Infect Immun 1983; 42:763-70. 10. Hamada S. et al.: Development of preventive measures based on the aetiology of dental caries: A review. Microbial Ecol Health Dis 1996; 9:349-57. 11. Loesche W.J.: Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev 1986; 50:353-80. 12. Matsumoto M. et al.: Inhibitory effects of oolong tea extract on caries-inducing properties of mutans streptococci. Caries Res 1999; 33:441-5. 13. Ooshima T. et al.: Reduction of dental plaque deposition in humans by oolong tea extract. Caries Res 1994; 28:146-9. 14. Tagashira M. et al.: Inhibition by hop bract polyphenols of cellular adherence and water-insoluble glucan synthesis of mutans streptococci. Biosci Biotech Biochem 1997; 61:332-5. 15. Yanagida A. et al.: Inhibitory effects of apple polyphenols and related compounds on cariogenic factors of mutans streptococci. J Agric Food Chem 2000; 48:5666-71. 16. Okuda T. et al.: Relationship of the structures of tannins to the binding activities with hemoglobin and methylene blue. Chem Pharm Bull 1985; 33:1424-33.
