© Borgis - Nowa Stomatologia 2/2001, s. 11-14
Izabella Strużycka, Katarzyna Rucińska, Marta Radziejewska
Wybrane metody oceny występowania bakterii z gatunku Streptococcus mutans w środowisku jamy ustnej
Methods of evaluation of Streptococcus mutans in the oral cavity
z Zakładu Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii Akademii Medycznej w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Maria Wierzbicka
Bakterie z gatunku Streptococcus mutans (SM) są uznawane za jeden z głównych czynników etiologicznych próchnicy (1, 2, 3, 4). Opublikowano wiele prac naukowych na temat występowania i rozpowszechniania tego drobnoustroju w różnych krajach świata (1, 5, 6).
W wielu populacjach liczba bakterii z rodzaju SM w ślinie stymulowanej jest jednym z kryteriów stosowanych w prognozowaniu próchnicy oraz selekcji grup i indywidualnych osób z ryzykiem próchnicy (1, 3, 7, 8, 9, 10, 11). W związku z powyższym stosowane są różne metody identyfikacji i oceny ilościowej SM, dla potrzeb szerokich badań epidemiologicznych jak i dla potrzeb gabinetu stomatologicznego.
Wśród metod służących ocenie poziomu bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w ślinie, płytce nazębnej lub na powierzchni zębów można wyróżnić dwie podstawowe grupy metod. Pierwszą stanowią metody laboratoryjne, drugą zaś takie, które można stosować w warunkach gabinetu stomatologicznego. W przypadku metod laboratoryjnych ślina lub płytka nazębna pobierane od pacjenta są mieszane z podłożem transportowym i przesyłane do laboratorium bakteriologicznego. Po inkubacji na podłożu selektywnym, kolonie Streptococcus mutans na płytkach agarowych są liczone, a ich poziom wyraża się liczbą jednostek tworzących kolonie CFU/ml śliny (CFU – ang. Colony forming units). Istnieje wiele podłoży selektywnych, które używa się do hodowli Streptococcus mutans (6). Niektóre z nich wymieniono w tabeli 1 (5, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21). Podłoża te różnią się między sobą składem i właściwościami (1, 6, 12).
Główny typ podłoży agarowych selektywnych dla bakterii z gatunku Streptococcus mutans to mitis-salivarius-bacitracin (MSB) – agar. Stosując to podłoże można uzyskać wzrost wszystkich serotypów SM z wyjątkiem rzadkiego serotypu a. Bacytracyna spełnia tutaj główną rolę selekcyjną. W przypadku stosowania metody tradycyjnej z użyciem płytek agarowych powszechnie używa się metody rozcieńczeń próbek śliny (zwykle 10, 100, 1000 razy), które następnie w określonej ilości (0,1 ml) umieszcza się na płytkach odpowiednio dla każdego z rozcieńczeń. Po inkubacji liczy się liczbę kolonii i wyraża je liczbą CFU. Procedura jest wielostopniowa, wymaga specjalnie przeszkolonego personelu i oprzyrządowania w postaci płytek, pipet i probówek (6). Z tego też powodu wprowadzono do użycia prostsze metody, które mogą mieć zastosowanie w gabinecie stomatologicznym.
W mikrometodzie wg Westergrena i Krassa (22) wprowadzono modyfikację polegającą na zastosowaniu półautomatycznej mikropipety nakraplającej po 25 ml z każdego rozcieńczenia próbki śliny na 1/3 płytki agarowej. W ten sposób zmniejsza się znacznie liczba potrzebnych płytek agarowych.
Inna metoda oceny poziomu SM w ślinie stymulowanej, znacznie prostsza, tzw. spatula method może być stosowana w badaniach screeningowych a została opisana przez Köhler i Bratthalla (23). Polego ona na zastosowaniu płaskiej szpatułki drewnianej, którą po kontakcie ze śliną odciska się na płytce agarowej. Pacjentowi poleca się żuć kostkę parafiny przez około 3 minuty, a następnie używa się drewnianej szpatułki (151 x 18 mm), aby zebrać ślinę obracając ją około 10 razy w ślinie na języku i usuwając jej nadmiar poprzez lekko zwarte wargi pacjenta. Następnie odciska się natychmiast obie strony szpatułki na płytce agarowej. Inkubacje przeprowadza się przez 48 godzin w temp. 37°C w warunkach beztlenowych (95% N2 + 5% CO2). Liczba jednostek tworzących kolonie dwóch odcisków jest liczbą odpowiadającą liczbie bakterii u danego pacjenta. Przygotowane płytki agarowe mogą być przechowywane w lodówce, ale powinny zostać wykorzystane w ciągu jednego tygodnia (ze względu na niestabilność bacytracyny) co jest słabą stroną tej metody badania.
Inna praktyczna metoda określana mianem "Loop method” została opisana przez Beightona (24). Polega ona na inkubacji na płytkach z agarem MSB rozcieńczonego roztworu izotonicznego buforu fosforanowego, z dodatkiem próbki pobranej z powierzchni języka. Inkubacja w środowisku 10% CO2 odbywa się przez 3-4 dni w temp. 37°C.
Wśród stosowanych do oceny poziomu bakterii z rodzaju Streptococcus mutans testów wymienić należy również testy kolorymetryczne wg. Waltera i Shklaira (25) a także Loesche i Bhat (26). Autorzy ci stosowali podłoża zawierające wskaźnik na bazie kwasu do oceny poziomu SM w płytce lub ślinie. Zmiany koloru w podłożu mannitol – arginina były związane z poziomem bakterii z rodzaju Straptococcus mutans w płytce nazębnej (12).
Alaluusua i wsp. (20) wprowadzili do użycia test Dentocult SM, Orion Diagnostica, Finland do oceny poziomu Streptococcus mutans w ślinie. Na specjalnie przygotowane płytki pokryte agarem MSB posiewa się ślinę wcześniej stymulowaną żuciem kostki parafiny. Jednocześnie krążek z bacytracyną (5 mg) jest umieszczany na płytce z posiewem. Test jest oceniany na podstawie gęstości wzrostu kolonii Streptococcus mutans wewnątrz strefy otaczającej krążek.
Matsukubo opracował półilościową metodę oceny krytycznych poziomów bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w ślinie, opierając się na zdolności mikroorganizmów do wzrostu adhezyjnego na częściach szklanych naczyń (18). Szklane probówki zawierające selektywną pożywkę MSB są zwilżane śliną, inkubowane w warunkach tlenowych przez 24 godziny i oceniane pod kątem gęstości wzrostu adhezyjnego. Metoda ta została porównana z „spatula method” Köhler i Bratthalla (23). Potwierdzono przydatność obu testów do badań skreeningowych i do praktyki klinicznej.
Metoda „strip mutans” jest modyfikacją metody z zastosowaniem szpatułki „spatula method” i wykorzystuje zdolności bakterii z rodzaju Streptococcus mutans do wzrostu na twardych powierzchniach w pożywce selektywnej (23, 27). Znajduje obecnie bardzo szerokie zastosowanie. Pozwala na długoterminowe, w odróżnieniu od poprzedniej metody, wykorzystanie podłoża i długie przechowywanie pasków z wyhodowanymi koloniami SM.
Tabela 1. Podłoża używane do identyfikacji i oceny ilościowej bakterii z rodzaju Streptococcus mutans.
| Rodzaj podłoża | Właściwości |
| MS-agar (Difco, Detroit, USA) (12) | Identyfikacja na podstawie morfologii kolonii |
| MC-agar (Carlsson) (13) | Agar selektywny dla Streptococcus mutans na bazie MS-agaru. Niektóre szczepy - serotyp d/g nie wskazują wzrostu |
| MSB (Gold, Jordan, van Houte) (14) | Agar selektywny dla Streptococcus mutans na bazie MS-agaru. Streptococcus mutans - serotyp a nie wskazuje wzrostu |
| BCY (Ikeda i Sandham) (15) | Podłoże nieselektywne - identyfikacja na podstawie morfologii kolonii |
| MM10-sucrose (Syed i Loesche) (16) | Podłoże nieselektywne - identyfikacja na podstawie morfologii kolonii |
| TYCSB (Palestein Helderman, Ijsseldijk i Huis in´t Veld) (17) | Identyfikacja na podstawie morfologii kolonii. Możliwe różnicowanie pomiędzy serotypami c/e/f i d/g ale nie pomiędzy b i c/f/f. Serotyp a nie wskazuje wzrostu |
| Podłoże selektywne wg. Matsukubo (18) | Na bazie podłoża MSB. Serotyp a nie wskazuje wzrostu |
| Podłoże selektywne wg Kalfasa, Edwardssona i Birkheda (19) | Modyfikacja MC - agaru i metody Matsukubo |
| Dentocult SM (Orion Diagnostica, Helsinki, Finland) (20) | Metoda z zastosowaniem plastikowych nośników agaru oraz krążka z bacytracyną. Serotyp a nie wykazuje wzrostu |
| TSY20B (Schaeken, van der Hoeven i Franken) (21) | Modyfikacja podłoża TYCSB (łatwiejsze w użyciu) |
| Strip mutans (Jansen i Bratthall) (5) | Modyfikacja MS - agaru z wysoką koncentracją sacharozy (osobno krążek z bacytracyną) |
W skład testu „strip mutans”wchodzi probówka z podłożem selektywnym (bulion z wysoką koncentracją sacharozy) i plastikowy pasek. Podłoże jest aktywowane poprzez dodanie krążka bacytracyny na 15 min. przed planowanym wykonaniem testu. Oznaczanie ilościowe bakterii z rodzaju Streptococcus mutans w ślinie polega na wzroście paciorkowców w podłożu wybiórczym płynnym i na ich adherencji na pasku testowym. Wydzielanie śliny stymuluje się żuciem kostki parafiny przez ok. 1 min. Pasek testowy „strip mutans” wprowadza się do jamy ustnej badanego i obraca dziesięciokrotnie w ślinie na języku. Następnie poleca się pacjentowi lekkie zaciśnięcie warg w celu usunięcia nadmiaru śliny. Pasek umieszcza się w firmowej probówce z płynnym podłożem hodowlanym i inkubuje się materiał w temp. 37°C (310 K) przez 48 godzin. Liczbę kolonii bakterii ocenia się przez porównanie zagęszczenia jednostek tworzących kolonie z wzornikiem firmowym po uprzednim osuszeniu paska.
Poziom SM w ślinie stymulowanej wyraża się w czterostopniowej skali:
0 – nie stwierdza się kolonii o cechach morfologicznych Streptococcus mutans;
1 – liczba bakterii mniejsza niż 105/ml śliny;
2 – liczba bakterii od 105 do 106/ml śliny;
3 – liczba bakterii powyżej 106/ml śliny.
Metoda „strip mutans” jest przydatna zarówno w badaniach dotyczących pojedynczych przypadków jak i w badaniach na poziomie populacji. Może ona służyć między innymi do: identyfikacji osób z wysokim ryzykiem próchnicy, oceny czynników ryzyka próchnicy, monitorowania pacjentów poddanych programom profilaktycznym (7, 9).
Zalety tej metody to:
– łatwość wykonania – może być przeprowadzona przez osoby przyuczone, bez doświadczenia w pracy laboratoryjnej;
– trwałość – podłoże przechowywane w 4°C zachowuje przydatność do użycia przez 6 miesięcy;
– łatwość odczytu – łatwość zliczania kolonii i oceny ich morfologii;
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Bratthall D., Carlsson J.: Texbook of cariology. Munksgaard, 1986. 2. Emilson C.G., Krasse B.: Support for and implications of the specific plaque hypothesis. Scand. J. Dent. Res. 1985, 93:96-99. 3. Kreulen C.M.et al.: Streptococcus mutans in children using nursing bottles. J. of Dent. for Childr. 1997, 64(2):107-111. 4. Mudorff-Screstha S.A. et al.: Cariogenic potential of foods. Caries Res., 1994, 28:106-115. 5. Bratthall D.: Demonstration of Streptococcus mutans strains in some selected areas of the world. Odontol. Revy. 1972, 23:401-405. 6. Tenovuo J.O.: Human saliva: clinical chemistry and microbiology. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida 1989, 2. 7. Bratthall D. et al.: Evaluation of a simplified method for site-specific determination of mutans streptococci levels. Swed. Dent. J. 1996, 20:215-220. 8. Togelius J. et al.: Streptococcus mutans in seliva, intraindividual variations and relation to the number of colonoized sites. Acta Odont. Scand. 1984, 42:157-163. 9. Wierzbicka M. i wsp.: Intensywność próchnicy a występowanie w ślinie stymulowanej bakterii z grupy streptococcus mutans u 6-letnich dzieci. Czas. Stomat., 1997, L, 1:8-11. 10. Wojcieszek D. i wsp.: Metoda oznaczeń bakterii Streptococcus mutans w ślinie z użyciem fabrycznego podłoża Dentocult SM – Strip Mutans. Czas. Stom., 1992, XLV, 9:446-449. 11. Vehkalahti M. Et al.: Evaluation of salivary tests and dental status in the prediction of caries increment in caries susceptible teenagers. Caries Res., 1996, 30:22-28. 12. Jordan H.V.: Cultural methods for the identification and quantitation of Streptococcus mutans and lactobacilli in oral samples. Oral Microbiol, Immunol. 1986, 1:23-27. 13. Carlsson J.: Presence of various types of non-haemolytic streptococci in dental plaque and in other sites of the oral cavity in man. Odontol. Revy. 1967, 18:55-58. 14. Gold O.G. et al.: A selective medium for Streptococcus mutans. Arch. Oral Biol. 1973, 17:601-605. 15. Ikeda T., Sandham H.J.: A Medium for recognition and enumeration of Streptococcus mutans. Arch. Oral Biol. 1972, 17:601-604. 16. Syed S.A., Loesche W.J.: Survival of human dental plaque flora in various transport media. Appl. Microbiol. 1972, 24:638. 17. van Palenstein Helderman W.H. et al.: A selective medium for the two major subgroups of the bacterium Streptococcus mutans isolated from human dental plaque and saliva. Arch. Oral Biol. 1983, 28:599. 18. Matsukubo T. et al.: A semi-quantitative determination of Streptococcus mutans, using its adherent ability in a selective medium. Caries Res. 1981, 15:40-45. 19. Kalfas S. Et al..: Determination of salivary Streptococcus mutans level in a stable sucrose – sulphasomidine containing broth. Caries Res. 1985, 19:320. 20. Alaluusua S. et al.: Slide scoring method for estimation of Streptococcus mutans levels in saliva. Scand. J. Dent. Res. 1984, 92:127-133. 21. Schaeken M.J.M. et al.: Comparative recovery of Streptococcus mutans of five isolation media including a new simple selective medium J. Dent. Res. 1986, 65:906. 22. Wertergren G., Krasse B.: Evaluation of a micromethod for determination of Streptococcus mutans and Lactobacillus infection. J. Cli. Microbiol. 1978, 7:82-86. 23. Köhler B., Bratthall D.: Practical method to facilitate estimation of Streptococcus mutans levels in saliva. J. Clin. Microbiol. 1979, 9:584-587. 24. Beighton D.: A simplified procedure for estimating the level of Streptococcus mutans in the mouth. Br. Dent. J. 1986, 160:329-333. 25. Walter R.G., Shklair I.L.: Streptococcus mutans in caries free and caries active naval recruits. J. Dent. Res. 1982, 61:1229-1232. 26. Loesche W.J., Bhat M.: Evaluation of diagnostic broths for Streptococcus mutans. Sp. Supp. Microbiology Abstracts 1976, 1:291-301. 27. Jensen B., Bratthall D.: A new method for estimation of mutans streptococci in human saliva. J. Dent. Res. 1989, 68 (3):468-471. 28. Netuschil L. et al.: Plaque bacteria counts and vitality during chlorhexidine meridol and listerine mouthrinses. Eur. J. Oral. Sci., 1995, 103:355-361.
