© Borgis - Nowa Stomatologia 3/2009, s. 85-89
*Izabela Strużycka, Izabela Stępień
Biofilm – nowy sposób rozumienia mikrobiologii
Biofilm – a new understanding of the microbiology
Zakład Stomatologii Zachowawczej Instytutu Stomatologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Elżbieta Jodkowska
Poznanie struktury oraz mechanizmów funkcjonowania biofilmu bakteryjnego przyczyniło się do zrozumienia patogenezy wielu zakażeń oraz umożliwiło ich skuteczne zapobieganie i leczenie.
Mimo iż powszechnie istnieje przekonanie, że podstawową formą bytowania mikroorganizmów jest forma planktonu, swobodnie przemieszczającego się w płynach ustrojowych lub w innym środowisku uwodnionym, należy wiedzieć, że już w XVII wieku pisano o zdolności tworzenia przez mikroorganizmy „stacjonarnych zespołów komórek zanurzonych w śluzowatej substancji pozakomórkowej”. Tak wówczas opisano po raz pierwszy występującą na zębach płytkę bakteryjną (1).
Bakteriolodzy przez wiele następnych lat próbowali zgłębić tajemnice życia drobnoustrojów w biofilmach, za pomocą zwykłych mikroskopów świetlnych, jednak głębsze warstwy konglomeratów bakteryjnych nie były dostępne przy zastosowaniu tej metody badania. Uważano zatem, że komórki bakteryjne znajdujące się w głębszych warstwach biofilmu są martwe i tworzą przypadkowe skupiska drobnoustrojów. Dopiero około roku 2002 naukowcy po raz pierwszy zastosowali do badań laserowy skaningowy mikroskop konfokalny, który umożliwił uzyskanie obrazu poszczególnych warstw żywego biofilmu, a po ich złożeniu otrzymano trójwymiarowe odwzorowanie tego zadziwiającego tworu (1).
Biofilm może składać się z jednego lub wielu gatunków mikroorganizmów otoczonych warstwą zewnątrzkomórkowych polisacharydów. Powstaje w wyniku wielowarstwowego lub jednowarstwowego wzrostu drobnoustrojów, które układają się w uporządkowane, skomplikowane struktury, złożone z mikrokolonii bakteryjnych. Biofilm zbudowany bywa z niezliczonej liczby mikrokolonii, które poprzedzielane są siecią otwartych kanałów. Krążąca w kanalikach ciecz opływa mikrokolonie, dostarczając substancji odżywczych, tlenu i usuwając zbędne produkty przemiany materii. Ten system wodno-kanalizacyjny działa na obrzeżach mikrokolonii, natomiast bakterie znajdujące się wewnątrz są od niego częściowo odcięte. Gęste skupiska bakterii połączonych substancją pozakomórkową hamują przepływ krążącego w kanalikach płynu. Komórki żyjące wewnątrz korzystają więc ze składników odżywczych, które zdołają dotrzeć do wnętrza mikrokolonii. Dlatego też komórki bakteryjne położone w głębszych warstwach są wprawdzie żywe, ale znajdują się w stanie anabiozy – „uśpienia”.
W związku z warstwową budową, w biofilmie panują zróżnicowane warunki środowiska chemicznego (2). Powoduje to różnorakie konsekwencje. Bywa, że jedna komórka bakteryjna może wyglądać, zachowywać się inaczej niż druga, mimo że obie są genetycznie identyczne. Miejscowe warunki wpływają na wytwarzanie przez drobnoustroje wielu toksyn i substancji wywołujących choroby. Biofilmy nie dają się pokonać mechanizmom obronnym uruchamianym przez układ odpornościowy. Często nawet antybiotykom czy innym środkom przeciwbakteryjnym nie udaje się pokonać lepkiej substancji polisacharydowej i przedostać do ich wnętrza. Zmienne warunki środowiska i zróżnicowanie gatunkowe mikroorganizmów w biofilmach zapewnia im dostateczną ochronę przed środkami przeciwbakteryjnymi. Różnice środowiska pozwalają na życie różnych gatunków drobnoustrojów obok siebie, gdzie, np., bakterie jednego gatunku żywią się zbędnymi metabolitami bakterii innego gatunku, z korzyścią dla obu (1, 2, 3).
Bakterie nie są jedynymi drobnoustrojami zdolnymi do tworzenia biofilmów. Cechę tą wykazują, między innymi również grzyby, drożdże czy pierwotniaki (2, 3). Posiadają one zdolność do przylegania do siebie nawzajem, a także do naturalnych i sztucznych powierzchni stałych. Taka właśnie forma bytowania wydaje się być podstawowa dla drobnoustrojów występujących w naturze, czy też kolonizujących organizmy żywe. Oceniono, że około 95% mikroorganizmów żyjących w naturze tworzy biofilmy (1, 2, 3, 4).
Biofilmy są niemalże wszechobecne są na stałych podłożach w środowisku wodnym lub wilgotnym środowisku powietrznym, na powierzchni tkanek organizmów żywych, na granicy fazowej cieczy i gazu. W środowisku, gdzie występują turbulentne przepływy, biofilm przybiera postać rozciągniętych pasków, rozłożonych w cienkiej warstwie. Natomiast w środowiskach wodnych o leniwym przepływie, biofilm tworzy swoją masę w postaci „grzyba”.
Wczesne badania nad biofilmem, pierwsze z nich opisywane w latach 40-tych, dotyczyły głównie naturalnych środowisk wodnych oraz urządzeń wodociągowych i kanalizacyjnych (3). Bakterie śluzowych biofilmów powstających wewnątrz rur wykazują aktywność metaboliczną, wytwarzając kwas, uszkadzają w ten sposób rury i przewody kanalizacyjne lub gazowe.
Występowanie biofilmu w medycynie najwcześniej stwierdzono na powierzchniach zębów – gdzie tworzy on płytkę nazębną (5). W organizmie człowieka biofilmy obserwowano również na powierzchni błon śluzowych głównie układu oddechowego, moczowo-płciowego i pokarmowego. Dalsze badania ujawniły, że biofilmy występują w wielu innych miejscach organizmu ludzkiego. Tworzą się one na powierzchni tworzyw sztucznych, ceramiki, metali – materiałów, z których zbudowane są cewniki, sztuczne zastawki, soczewki kontaktowe, protezy i implanty, ale także na ciałach obcych, kamieniach moczowych lub żółciowych (3, 6, 7).
Powstawanie biofilmu na materiałach obcych związane jest ze współdziałaniem pomiędzy komórkami mikroorganizmu a komórkami makroorganizmu (8). Bakterie odznaczają się silnym powinowactwem do biomateriałów i dużą zdolnością ich zasiedlania. Skuteczność kolonizacji makroorganizmu i powstawanie biofilmu zależy od wielu czynników, takich jak właściwości drobnoustrojów, funkcjonowanie mechanizmów obronnych, budowa i właściwości biomateriałów. Przebieg procesu kolonizacji jest znacznie ułatwiony z jednej strony przez strukturę powierzchni oraz osiadanie na nich makrocząsteczek produkowanych przez organizm gospodarza, z drugiej strony, przez obecność różnych struktur zewnątrzkomórkowych mikroorganizmów, pełniących funkcje adhezyn, takich jak fimbrie, rzęski, lipopolisacharydy i białka ściany komórkowej. Tworzeniu silnych wiązań drobnoustrojów z powierzchnią stałą sprzyjają białka gospodarza, takie jak glikoproteiny macierzy zewnątrzkomórkowej: fibrynogen, kolagen czy fibronektyna, które pokrywają materiały obce tuż po ich wprowadzeniu do organizmu. Istotne znaczenie w procesie adhezji ma także budowa wprowadzanych biomateriałów. Ułatwia ją chropowatość powierzchni. Badania wykazują, że szczególnie korzystne warunki dla kolonizacji drobnoustrojów stwierdza się na materiałach wykonanych z polichlorku winylu lub na lateksie pokrytym silikonem (8, 9, 10).
Kluczowe znaczenie w tworzeniu struktury biofilmu przypisuje się również wielocukrom zewnątrzkomórkowym (EPS: extracellular polymer substances) zawierającym, m.in. mannozę i reszty glikozydowe, które budująotoczkę bakterii lub są uwalniane do otoczenia, gdzie wchodzą w skład śluzu. Składniki otoczki wraz ze śluzem tworzą glikokaliks, który umożliwia i ułatwia proces adhezji do gładkich powierzchni tworzyw sztucznych i metali, z których zbudowane są biomateriały (10).
Pierwszym etapem tworzenia się biofilmu jest adhezja komórek bakterii swobodnie pływających tzw. ”planktoidalnych” do podłoża. Bezpośrednio po kontakcie z powierzchnią, bakterie rozpoczynają wędrówkę dopóki nie natrafią na inne drobnoustroje, tworząc nową mikrokolonię lub powiększając już istniejącą (6, 11, 12, 13). Początkowo komórki te wiążą się z podłożem na zasadzie niespecyficznych, odwracalnych oddziaływań, takich jak: siły grawitacyjne, elektrostatyczne, hydrofobowe van der Waalsa pomiędzy bakteryjnymi adhezynami, otaczającym płynem i powierzchnią stałą. W tej fazie istotną rolę odgrywają zewnątrzkomórkowe struktury bakteryjne, zwłaszcza białkowe wyrostki – fimbrie. Na fimbriach występują grupy hydrofobowe, dzięki którym bakterie łatwiej pokonują siły odpychania pomiędzy ujemnie naładowanymi komórkami gospodarza i powierzchnią drobnoustroju. Tym samym znacznie szybciej przyłączają się bakterie zaopatrzone w różnego typu wyrostki niż szczepy bezrzęskowe.
W następnym etapie w wyniku specyficznych procesów chemicznych bakterie kolonizują podłoże w sposób nieodwracalny. Dochodzi do interreakcji typu „klucz-zamek”, adhezyny bakteryjnej i określonego ligandu w cząsteczkach eksponowanych na powierzchni komórki eukariotycznej lub podłoża sztucznego wprowadzonego do organizmu człowieka (11, 12).
Po etapie adhezji rozpoczyna się namnażanie drobnoustrojów i ich różnicowanie. Bezpośrednio po przywarciu bakterii do podłoża w komórce dochodzi do aktywacji lub hamowania ekspresji niektórych genów. Dojrzewanie biofilmu jest związane ze zmianami aktywności poszczególnych genów w zależności od warunków i potrzeb oraz wystąpieniem odpowiednich cech fenotypowych. W związku ze zmianami środowiska, np. ograniczonym dostępem tlenu zmienia się metabolizm komórek – wzrasta aktywność beztlenowych szlaków metabolicznych glikolizy, fermentacji, zahamowaniu ulega synteza niektórych enzymów, np. proteaz, fosfolipazy C oraz toksyn. Dochodzi także do zahamowania produkcji flagelliny, białka wchodzącego w skład rzęsek u bakterii gramujemnych. W konsekwencji zanikają też niektóre struktury, np. rzęski, które są już niepotrzebne w tej „stacjonarnej” formie bytowania w biofilmie (11).
Komórki wielu gatunków bakterii wchodzących w skład biofilmu wykazują odmienne cechy niż komórki żyjące w postaci wolnej (9). Gdy bakterie przytwierdzają się do podłoża, wytwarzają setki białek niewystępujących u drobnoustrojów prowadzących swobodny tryb życia. Niektóre z tych białek biorą udział w procesie zwanym „dziwacznym przetasowaniem komórek” zaraz po osiedleniu się na podłożu. Nasila się także produkcja polimerów wchodzących w skład substancji zewnątrzkomórkowej stanowiącej niezbędny składnik biofilmu. Zmiany te przystosowują komórkę bakterii do osiadłego trybu życia. Organizacja biofilmu wymusza liczne zmiany genetyczne nadające komórkom specyficzne właściwości przekazywane następnie komórkom sąsiadującym lub potomnym.
Początkowo podłoże pokryte jest jedną warstwą komórek drobnoustrojów spojonych polimerem zewnątrzkomórkowym. Z czasem komórki dzielą się, a na powierzchni przyczepiają się coraz to nowe komórki drobnoustrojów. Powstaje w ten sposób wielokomórkowy twór o skomplikowanej strukturze.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Donlan RM: Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis 2002; 8: 136-151. 2. Gebel J, Exnur M: Biofilmy – występowanie i kontrola. Aseptyka 2004; 6: 7-15. 3. Costerton JW et al.: Biofilms the customized microniche. J Bacteriology 1994; 176: 37-42. 4. Dorocka-Bobkowska B, Konopka K: Powstawanie biofilmu Candida i jego znaczenie w patogenezie zakażeń przewlekłych – przegląd piśmiennictwa. Dent Med Prob 2003; 40: 405-410. 5. Marsh PD: Dental plaque as a microbial biofilm. Caries Res 2004; 38: 204-211. 6. Kosikowska U, Malm A: Biofilm in vivo – intrygujące wyzwanie dla nauki. Farm Pol 2004; 60: 291-297. 7. Wiater A, Pleszczyńska M: Usuwanie płytki protez przez wybrane enzymy glukanolityczne. Dent Med Probl 2005; 42: 241-247. 8. Verstraeten N et al.: Living on a surface: swarming and biofilm formation. Trends Microbiol 2008; 16: 496-506. 9. Bryers JD: Medical biofilms. Biotechnol Bioeng 2008; 100: 1-18. 10. Talsma SS: Biofilms on medical devices Home Health Nurse 2007; 25: 589-594. 11. Monds RD, O´Toole GA: The developmental model of microbial biofilms: ten years of a paradigm up for review. Trends Microbiol 2009; 2: 73-87. 12. Aparna MS, Yadav S: Biofilms: microbes and disease. Braz J Infect Dis. 2008; 12; 526-30. 13. Jain A et al.: Biofilms-a microbial life perspective: a critical review. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 2007; 24: 393-443. 14. Ghigo JM: Natural conjugative plasmids induce bacterial film development. Nature 2001; 412: 442-445. 15. de Kievit TR: Quorum sensing in Pseudomonas eruginosa biofilms. Environ Microbiol. 2009; 2: 279-88. 16. Jayaraman A, Wood TK: Bacterial quorum sensing: signals, circuits, and implications for biofilms and disease. Annu Rev Biomed Eng 2008; 10: 145-167. 17. Irie Y, Parsek MR: Quorum sensing and microbial biofilms. Curr Top Microbiol Immunol. 2008; 332: 67-84. 18. Miller MB, Bassler BL: Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 2001: 165-199. 19. Kolenbrander PE et al.: Communication among bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 2002; 66: 486-450. 20. Schlesinger Milton J: Heat shock proteins J Biol Chem. 1990; 21: 2111-2114. 21. Watnick P, Kolter R: Biofilm city of microbes. J Bacteriology 2000; 182: 1675-2679. 22. Sbordone L, Bortolaia C: Oral biofilms and plaque-related disease microbial communities and their role in the shift from oral health to disease. Clin Oral Invest 2003; 7: 181-188. 23. Stewert PS, Costerton JW: Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet 2001; 358: 135-138. 24. Lewis K: Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 999-1007. 25. Vilcox MH et al.: In situ measurement of linezolid and vancomycin concentrations in intravascular cathether-associated biofilm. J Antimicrob Chemother 2001: 47: 171-175. 26. Ghani M, Soothill JS: Ceftazidime, gentamicin, and rifampicinin combinationkill biofilms of mucoid Pseudomonas aeruginosa. Can J Microbiol 1997; 43: 999-1004.
