© Borgis - Postępy Fitoterapii 2/2008, s. 70-75
*Elżbieta Hołderna-Kędzia1, Henryk Ostrowski-Meissner2, Bogdan Kędzia1
Ocena aktywności antybiotycznej nowozelandzkiego miodu manuka metodą rozcieńczeń seryjnych w podłożu płynnym
ESTIMATION OF ANTIBIOTIC ACTIVITY OF NEW ZEALAND MANUKA HONEY BY THE METHOD OF SERIAL DILUTIONS IN LIQUID MEDIUM
1Instytut Roślin i Przetworów Zielarskich w Poznaniu
Dyrektor Instytutu: dr hab. n. med. Przemysław M. Mrozikiewicz
2Faculty of Health Studies, Charles Sturt University, Sydney, Australia
Summary
In the studies has been compared the antibiotic activity declared by producer of manuka honey samples using the well method with phenolic equivalent, with their activity determined by the method of serial dilutions in liquid medium. It were investigated 50 samples of manuka honey from New Zealand and Australia. The samples were been divided in 5 groups: 13 samples with nondetermined of UMF value (group A), 13 samples with the value UMF 5+ (group B), 12 samples with the value UMF 10+ (group C) also 7 and 5 samples with the values respectively 15+ (group D) and 20+ (group E). The mean inhibine values obtained for samples of each groups were: 2.7 (group A), 3.0 (group B), 3.1 (group C), 3.5 (group D) and 3.8 (group E).
It was shown that the manuka honey samples belonging to groups A, B, and C were less antibiotic active (inhibine value ≤3), than samples belonging to groups D and E (inhibine value>3). The statistic studies shown, that between those groups of honey exists the statistic dependence (p<0.0001). Moreover basing on carried out comparative studies of methods of determination of antibiotic activity of manuka honey samples, the dependence between results obtained by determination of UMF values and estimation of inhibine value is not confirmed.
W ocenie aktywności antybiotycznej miodu napotyka się duże trudności. Są one spowodowane przede wszystkim stosowaniem różnych technik badawczych, różnych rodzajów szczepów wzorcowych i odmiennych podłoży bakteriologicznych w oznaczeniach przeprowadzanych przez różnych autorów. Jedne z najstarszych danych dotyczących działania miodu na drobnoustroje pochodzą z lat trzydziestych ubiegłego wieku. Wiedza na ten temat ograniczała się wówczas do obecności w miodzie bliżej nie zidentyfikowanej substancji zwanej „inhibiną” warunkującą to działanie (1). Dalsze badania prowadzone w połowie lat pięćdziesiątych przez Dolda i Witzenhausena doprowadziły do opracowania pierwszej metodyki określania tzw. wartości inhibinowej miodu, wyrażonej w stopniach od 0 do 5 i nazywanej od nazwiska ich twórcy skalą Dolda (2). Dalsza modyfikacja tej metody zaproponowana w 1959 przez Duisberga i Warnecke polegała na ocenie aktywności różnych próbek miodu wobec szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus, na podstawie ich wartości inhibinowej podanej w skali od 0 do 5 i wyliczonego w oparciu o nią wskaźnika stężenia inhibiny (3). Jako jeden z pierwszych autorów polskich przeniósł tę metodę na grunt naszych badań Curyło (4). Zakładała ona określanie aktywności antybiotycznej miodu w podłożu płynnym, wobec szczepu wzorcowego Staphylococcus haemolyticus i wyrażenie jej za pomocą wartości inhibinowej określonej liczbą od 0 do 5. Dla próbek miodu, które nie hamowały wzrostu szczepu wzorcowego w stężeniu 25% przyjmowano wartość inhibinową 0, dla tych, które hamowały wzrost szczepu w stężeniu 25% – wartość inhibinową 1, w stężeniu 20% – wartość inhibinową 2, w stężeniu 15% – wartość inhibinową 3, w stężeniu 10% – wartość inhibinową 4 i w stężeniu 5% – wartość inhibinową 5.
Modyfikację tego sposobu określania aktywności antybiotycznej miodu znaleźć można w piśmiennictwie polskim na początku lat sześćdziesiątych ubiegłego stulecia. W badaniach prowadzonych przez Rychlik i Doleżal zastosowano metodę seryjnych rozcieńczeń miodu w podłożu płynnym, zwaną nadal metodą określania wartości inhibinowej miodu (5). Polegała ona na wykonaniu serii dwukrotnych rozcieńczeń miodu w płynnym podłożu bakteriologicznym, od 1:2 (50% roztwór miodu) do 1:64 (1,56% roztwór miodu). Do powyższego rzędu rozcieńczeń dodawano, rozpoczynając od najmniejszego stężenia miodu w probówce, po 1 kropli hodowli szczepów wzorcowych Staphylococcus aureus FDA 209P lub Escherichia coli O1110B4. Następnie po 20 godz. inkubacji próbek w temperaturze 37°C oceniano wzrost szczepu wzorcowego. Jeśli w obecności roztworu miodu o określonym stężeniu wystąpiło zahamowanie wzrostu badanego szczepu bakterii, przyjmowano, że jest to najmniejsze stężenie miodu, które działa jeszcze bakteriostatycznie. W oparciu o nie analizowana próbka miodu uzyskiwała określony stopień aktywności antybiotycznej wyrażany za pomocą liczb od 0 do 5. Do miodów o wartości inhibinowej 0 zaliczano próbki hamujące rozwój badanego szczepu w stężeniu 50%. Wartość inhibinową miodu działającego bakteriostatycznie w stężeniu 25% określano liczbą 1, w stężeniu 12,5% – liczbą 2, w stężeniu 6,25% – liczbą 3, w stężeniu 3,12% – liczbą 4 i w stężeniu 1,56% – liczbą 5. Warto dodać, że ten sposób oceny aktywności antybiotycznej miodów odmianowych nadal stosowany jest w różnych ośrodkach naukowych w naszym kraju.
W badaniach własnych, prowadzonych w Instytucie Roślin i Przetworów Zielarskich w Poznaniu, do określania aktywności antybiotycznej różnych próbek miodu krajowego i zagranicznego wykorzystywano również metodę dwukrotnych rozcieńczeń w podłożu płynnym, przy użyciu międzynarodowego szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus FDA 209P. Stężenie miodu, przy którym stwierdzano zahamowanie wzrostu szczepu wzorcowego, odnoszono do wartości inhibinowej oznaczonej w stopniach od 0 do 5 (6, 7).
Kolejną standardową metodą oznaczania aktywności antybiotycznej miodu jest metoda rozcieńczeń w podłożu agarowym. Polega ona na dodawaniu do upłynnionego podłoża agarowego rozlanego do płytek Petriego kolejnych rozcieńczeń miodu, dokładnym wymieszaniu i po zestaleniu się podłoża, posianiu na jego powierzchni hodowli odpowiedniego szczepu wzorcowego. W trakcie inkubacji próbek miód dyfunduje w otaczającej go objętości podłoża agarowego, dając częściowe lub całkowite zahamowanie wzrostu bakterii na płytkach. Stosując serię różnych stężeń miodu na płytkach agarowych można znaleźć minimalne stężenie próbki miodu hamujące wzrost wzorcowego szczepu bakterii (8). Pod koniec lat dziewięćdziesiątych Gonnet w badaniach aktywności antybiotycznej miodu zastosował metodę opracowaną przez Dolda i wsp. (9). Badaną próbkę miodu rozcieńczano fizjologicznym roztworem soli, a następnie mieszano z agarowym podłożem bakteriologicznym, celem uzyskania homogennej masy, i przenoszono do płytek Petriego. Na powierzchni podłoży po ich zestaleniu posiewano po kilka kropli zawiesiny szczepu B. subtilis Karon. Po 24 godz. inkubacji próbek oceniano wzrost hodowli badanych bakterii na płytkach w skali od 0 do 5 (9).
W dominującym ośrodku, zajmującym się między innymi badaniem jakości miodu, tj. w Oddziale Pszczelnictwa w Puławach, określano aktywność antybakteryjną, nazywaną również mianem aktywności inhibinowej, dużej liczby próbek krajowych miodów odmianowych. Metodykę badań oparto na wcześniejszej pracy Gonnet i Lavie (10) z późniejszymi modyfikacjami zawartymi w Methodes officielles d´analyse du miel z 1977 r., jak również z użyciem własnego szczepu wzorcowego Bacillus subtilis ATCC 663B (11, 12, 13). Aktywność antybakteryjną miodu wyrażano w stopniach umownych od 0 do 5, określając najmniejsze stężenie miodu hamujące wzrost szczepu użytego w badaniach. Próbki miodu, które nawet w stężeniu powyżej 25% nie hamowały wzrostu wzorcowego szczepu B. subtilis, uzyskiwały stopień 0, próbki hamujące wzrost tego szczepu w stężeniu 20-25% – stopień 1, w stężeniu 15-20% – stopień 2, w stężeniu 10-15% – stopień 3, w stężeniu 5-10% – stopień 4 i w stężeniu poniżej 5% – stopień 5.
Kolejną metodą stosowaną w praktyce do badania aktywności antybiotycznej miodu jest metoda studzienkowa. Opiera się ona na zjawisku dyfuzji w agarze. W tym celu hodowlę badanego szczepu wzorcowego posiewa się na powierzchni podłoża agarowego w płytce Petriego, bądź dodaje się ją bezpośrednio do podłoża. Następnie przy użyciu szablonu wycina się w podłożu małe otwory o średnicy 6-10 mm, zwane studzienkami i aplikuje się do nich niewielkie ilości miodu lub jego rozcieńczeń w jałowej wodzie destylowanej. W trakcie inkubacji próbek w odpowiedniej temperaturze, przez określony czas, miód dyfunduje do podłoża agarowego z miejsca jego zaaplikowania. W miejscach, w których stężenie miodu w agarze jest wystarczająco wysokie do zahamowania wzrostu hodowli bakterii, pojawia się strefa przejaśnienia. Następnie określa się wielkość stref zahamowania wzrostu hodowli badanego szczepu wzorcowego wokół studzienek, poprzez pomiar ich średnicy. Ponieważ miód w podłożu ulega dyfuzji, a więc rozcieńczaniu, należy pamiętać, że skuteczne stężenie antybakteryjne miodu będzie zawsze niższe niż stężenie zaaplikowanego do studzienki roztworu miodu. Z tego względu jest to metoda mniej czuła i dokładna, nadaje się jednak do porównania aktywności antybiotycznej różnych próbek miodu.
Niekiedy na podstawie rzędu rozcieńczeń miodu i pomiaru stref zahamowania wzrostu bakterii określa się wartość inhibinową miodu (8, 17).
Modyfikacje tej metody dotyczą zastosowania w badaniach różnych szczepów wzorcowych, odmiennych podłoży agarowych, a także różnych ilości aplikowanego do studzienek miodu. W badaniach antybiotycznych właściwości miodu prowadzonych w Oddziale Pszczelnictwa w Puławach mierzono średnice stref zahamowania wzrostu wzorcowych szczepów bakterii (w mm) wokół studzienek z różnymi próbkami miodu rzepakowego i gryczanego. Badania wykonywano według zmodyfikowanej metody studzienek opracowanej przez Izdebską i Gubańskiego (1966). Jako szczepów bakterii wzorcowych użyto Staphylococcus aureus i Escherichia coli (14).
Według danych rumuńskich wrażliwość bakterii na miód badano przenosząc po 3 krople nierozcieńczonego miodu do studzienek wyciętych w agarze o średnicy 6 mm. Wcześniej na powierzchni płytek agarowych posiewano następujące szczepy bakterii: S. aureus, B. anthracis, E. coli, Salmonella D., Salmonella B., B. cereus, L. monocytogenes (15).
Aktywność przeciwbakteryjną różnych próbek miodu ukraińskiego oznaczano w podłożu agarowym mięsno-peptonowym, na którego powierzchni posiewano hodowle badanych szczepów w liczbie 104 komórek w 1 ml. Do studzienek wyciętych w agarze aplikowano po 4 g miodu. Wśród wzorcowych szczepów bakterii znalazły się: S. aureus 209, E. coli, P. vulgaris, B. anthracis, S. enteritidis, S. dysenteriae (16).
Z kolei Zjuman wykorzystując metodę dyfuzji w podłożu agarowym określił aktywność antybiotyczną miodów dalekowschodnich, podając średnice stref zahamowania wzrostu badanych szczepów bakterii wzorcowych pod wpływem miodu. Do tego celu użył on wrażliwego zazwyczaj na substancje przeciwbakteryjne szczepu – Micrococcus lysodeicticus i opornego na nie szczepu – Escherichia coli (17).
W jednym z ośrodków krajowych oznaczano aktywność antybakteryjną próbek miodu, dodając do studzienek o średnicy 10 mm (wyciętych w podłożu agarowym) ich roztwory przygotowane w jałowej wodzie destylowanej w proporcji 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 i 1:64. Hodowle 24-godzinne wzorcowych szczepów bakterii ( Staphylococcus aureus 606, E. coli, S. dublin, S. agona, P. aeruginosa) posiewano uprzednio do upłynnionego podłoża agarowego. Po 24 godz. inkubacji w temperaturze 37°C mierzono strefy zahamowania wzrostu bakterii wokół studzienek zawierających określone stężenia miodu. Aktywność antybiotyczną miodu wyrażano dodatkowo za pomocą punktów w skali od 0 do 5. Miody hamujące wzrost bakterii w rozcieńczeniu 1:2 otrzymały 0 punktów, a w rozcieńczeniach 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 i 1:64 odpowiednio od 1 do 5 punktów (18).
Próbki miodu pochodzące z różnych rejonów Omanu i Afryki badano metodą studzienkową na ich aktywność antybakteryjną wobec szczepów S. aureus (NCTC 6571), E. coli (NCTC 10418) i P. aeruginosa (NCTC 10662). Hodowle przygotowane w jałowej wodzie destylowanej, w liczbie 106 komórek w 1 ml, posiewano na powierzchni podłoża agarowego do oznaczania wrażliwości. Do studzienek o średnicy 6 mm dodawano po 50 μl każdego roztworu miodu, w stężeniach od 1:2 do 1:16. Wyniki interpretowano w sposób typowy, mierząc średnice stref zahamowania wzrostu bakterii wokół studzienek z odpowiednimi roztworami miodu (19).
Nieco odrębną metodą oceny aktywności antybiotycznej, opracowaną w Nowej Zelandii, jest zmodyfikowana metoda studzienkowa. Służy ona do oznaczania w tym kraju rodzimych miodów, w tym miodu manuka. W metodzie tej oznaczoną aktywność antybiotyczną miodu odnosi się do siły przeciwdrobnoustrojowego działania standardowego środka antyseptycznego – fenolu (tak zwanego współczynnika fenolowego UMF (Unique Manuka Factor). Dla przykładu miód o współczynniku UMF 5+ odpowiada pod względem aktywności antybiotycznej sile działania 5% roztworu fenolu, a miód o współczynniku UMF 10+ – sile działania 10% roztworu fenolu (20). Dokładnie metoda ta opisana została przez Allena i wsp. (21). W badaniach zastosowano płytki o powierzchni 243x243x18 mm, do których dodawano odżywczego podłoża agarowego w ilości 150 ml i 18-godzinną hodowlę szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus ATCC 25923 w ilości 100 μl/płytkę. Po zastygnięciu płytek wycinano w agarze przy użyciu korkoboru i czarnego szablonu o wymiarach 243x243 mm 64 studzienki. Badane próbki miodu dodawano do studzienek w ilości 100 μl, w czterokrotnym powtórzeniu. Po 18 godz. inkubacji płytek w temperaturze 37°C umieszczano je pod szablonem i odczytywano średnice stref przejaśnienia wokół studzienek z próbkami miodu. Jednocześnie na innej płytce oceniano średnice stref przejaśnienia wokół każdego standardowego roztworu fenolu, na podstawie których wyliczano ich powierzchnię. Wartości te służyły do sporządzenia wykresu niezbędnego do oceny aktywności antybiotycznej badanych próbek miodu.
W podsumowaniu metod określania aktywności antybiotycznej miodu stwierdzić można, że każda z opisanych technik badawczych ma swoje znaczenie, niekiedy uzupełniają się wzajemnie. Tak jak metody rozcieńczeń w podłożu agarowym i studzienkowa doskonale nadają się do porównań aktywności antybiotycznej różnych próbek miodu, tak metoda rozcieńczeń seryjnych w podłożu płynnym pozwala stosunkowo najdokładniej określić wzrost bakterii w podłożu zawierającym różne stężenia miodu. W związku z tym wadą wymienionych sposobów badania jest brak korelacji pomiędzy wynikami uzyskanymi w trakcie równoległego oznaczania aktywności próbki miodu przy wykorzystaniu omawianych metod. Jednak niezależnie od metody, w żadnym przypadku nie można stwierdzić, czy badana próbka miodu działa bakteriobójczo; mogą to wykazać dopiero dalsze badania. W każdej metodzie określamy jedynie działanie bakteriostatyczne, które jest tym silniejsze, im bardziej można rozcieńczać próbkę miodu i nadal zachowuje ona swą aktywność antybiotyczną (8, 18).
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Dold H, Du DH, Dziao ST. Nachweis antibakterieller, hitze – und lichtempfindlicher Hemmungsstoffe (Inhibine) im Naturhonig (Blütenhonig). Z Hyg Infektions-krankh 1938; 120:155-67 (cyt. za Rychlik M, Doleżal M – 5). 2. Dold K, Witzenhausen R. Ein Verfahren zur Beurteilung der örtlichen inhibitorischen (keim vermehrungshemmenden) Wirkung von Honigsorten verschiedener Herkunft. Z Hyg Infektionskrankh 1955; 141; 333-7 (cyt. za Rychlik M, Doleżal M – 5). 3. Duisberg H, Warnecke B. Erhitzungs – und lichteinfluss auf Fermente und Inhibine des Honigs. Zeitsch Lebensm Forsch 1959; 111: 111-9 (cyt. za Curyło J. – 4). 4. Curyło J. Chemia i technologia miodu i wosku. W: Hodowla pszczół (Red. L. Bornus), PWRiL, Warszawa 1974; 463. 5. Rychlik M, Doleżal M. Właściwości inhibinowe niektórych miodów polskich. Pszczeln. Zesz. Nauk. 1961; 5:53-64. 6. Hołderna-Kędzia E, Kędzia B. Antybiotyczne działanie miodu. IX Krajowa Naukowo-Techniczna Konferencja Pszczelarska nt. Pozyskiwanie i zagospodarowanie miodu pszczelego. Częstochowa, 6 grudnia 2003; 83-94. 7. Hołderna-Kędzia E, Wójcik J, Kędzia B. Badania nad aktywnością antybiotyczną i działaniem przeciwutleniającym miodu. XLII Naukowa Konferencja Pszczelarska. Puławy 8-9 marca 2005; 143-57. 8. Molan PC. The antibacterial activity of honey. Bee World 1992; 73; 5-28. 9. Gonnet M. Naturalnyje antibioticzeskije faktory, soderżaszcziejsja w mede. W: Produkty pczełowodstwa – Piszcza, zdorowie, krasota. Izdat Apimondii, Bucharest 1988; 33-37. 10. Gonnet M, Lavie P. Influence du chauffage sur le facteur antibiotique présent dans les miels. Annales de I´Abeille (Paris) 1960; 3:349-64. 11. Rybak-Chmielewska H, Szczęsna T. Antibacterial activity of honey. Pszczelnicze Zeszyty Naukowe 1996; 2:279-80. 12. Rybak-Chmielewska H, Szczęsna T. Antybakteryjne właściwości miodu (I rok badań) XXXIII Nauk Konf Pszczel Puławy 1996; 66-67. 13. Rybak-Chmielewska H, Szczęsna T. Wpływ ogrzewania na właściwości inhibinowe miodu. XXIV Nauk Konf Pszczel Puławy 1997; 53-54. 14. Rybak H, Achremowicz B. Zmiany w składzie chemicznym miodów naturalnych i zafałszowanych zinwertowaną przez pszczoły sacharozą zachodzące podczas przechowywania. Pszczeln Zesz Nauk 1986; 30:19-35. 15. Greczanu A, Jenczu W. Antibioticzeskij effekt propolisa, pylcy i meda. Produkty pczełowodstwa. Piszcza, zdorowie, krasota. Izdat. Apimondia Bucharest 1988; 37-40. 16. Panczenko GN, Demkiewicz LI. Baktericydnoje swojstwo meda harpatskoj zony Ukrainy. Pczełowodstwo. Resp Meżwiedom Temat Nauczn Sbor Wypusk 18. Urożaj, Kiev 1988; 42-44. 17. Zjuman BW. O baktericidnosti meda. Pczełowodstwo 1990; 3:43-4. 18. Leszczyńska-Fik A, Fik M. Właściwości antybakteryjne niektórych miodów i wpływ ogrzewania na ich trwałość. Medycyna Wet. 1993; 49:415-9. 19. Al. Jabri AA, Nzeako B,Al. Mahrooqi Z,Al, et al. In vitro antibacterial activity of Omani and African honey. British J Biomed Sci 2003; 60:1-4. 20. http://bio.waikato.ac.nz/honey/special.shtml? printver. Waikato Honey Research Unit – What´s special about active manuka honey? 1-5. 21. Allen KL, Molan PC, Reid GM. A survey of the antibacterial activity of some New Zealand honeys. J Pharm Pharmacol 1991; 43:817-22.
