Streszczenie
W Polsce żyje dwa miliony chorych na cukrzycę, w Europie 16 milionów, na świecie 160 milionów. Według badań WHO w ciągu najbliższych 25 lat liczba ta ulegnie podwojeniu i w 2025 roku przewiduje się, że na świecie na cukrzycę będzie chorych 300 milionów ludzi. Dane te świadczą o epidemiologicznym charakterze schorzenia. Jednym z najpoważniejszych powikłań okulistycznych cukrzycy są zmiany w układzie naczyniowym gałki ocznej. Mimo prawidłowego prowadzenia leczenia pacjenta z cukrzycą objawy retinopatii występują po około 5 latach od rozpoznania choroby. Retinopatia cukrzycowa jest jednym z głównych powodów ślepoty pacjentów pomiędzy 20, a 74 rokiem życia. Do najwcześniejszych objawów patologii naczyniowej w cukrzycy należy pogrubienie błony postawnej kapilarów. Początkowo są to nieznaczne zmiany: przyleganie leukocytów do ścianek naczyń, zmiany w przepływie krwi, zanikanie perycytów, i przepuszczalności naczyń. Powikłania naczyniowe prowadzą do niedotlenienia siatkówki. Zamknięcie kapilarów powoduje niedotlenienie i uwalnianie patologicznych czynników nowotworzenia naczyń, co prowadzi do rozwoju retinopatii cukrzycowej. Dotychczas znanych jest wiele prób leczenia retinopatii cukrzycowej, lecz żadna z metod nie polega na zapobieganiu zmianom a jedynie jesteśmy w stanie spowolnić proces chorobowy i leczyć powikłania. Wykazano, że prawidłowo czynny przeszczep trzustkowy zapewnia całkowitą normalizację glikemii. Jednak z powodu konieczności dożywotniego prowadzenia niebezpiecznego leczenia immunosupresyjnego stosuje się ten typ operacji u niektórych chorych jedynie w przypadkach po przeszczepieniu nerki z powodu schyłkowej nefropatii cukrzycowej. W ostatnich latach ukazały się publikacje wskazujące, że eksperymentalne przeszczepienie w cukrzycy wysp Langerhansa przynosi unormowanie glikemii. W piśmiennictwie światowym brak jest dostatecznej liczby przekonywujących prac dotyczących potransplantacyjnego zachowania się naczyń siatkówki ani u chorych na cukrzycę, ani u myszy z cukrzycą, zwłaszcza leczonych ksenotransplantacją wysp Langerhansa. W dostępnej literaturze nie znaleziono podobnych prac wykorzystujących ksenotransplantację opłaszczonych wysp Langerhansa do oceny stanu retinopatii w modelu zwierzęcym w zależności od czasu wykonania przeszczepienia. Nie natrafiono także w piśmiennictwie światowym na żadne publikacje dotyczące badań mających na celu ocenę wpływu transplantacji wysp trzustkowych na stan nabłonka barwnikowego siatkówki. Wobec braku zgodności co do wpływu skutecznej transplantacji na powikłania cukrzycowe o typie retinopatii, podjęto odpowiednie badania doświadczalne na myszach, u których cukrzyca doświadczalna jest najlepiej poznana.
Badania miały na celu odpowiedzieć na pytanie:
Czy możemy powstrzymać lub zmniejszyć zmiany w siatkówce wywołane cukrzycą za pomocą przeszczepienia opłaszczonych, ksenogenicznych wysp trzustkowych?
W tym celu przeprowadzono badania na myszach BALBc. Posłużono się powszechnie obecnie stosowanym modelem cukrzycy streptozotocynowej, wstrzykując myszom odpowiednią dawkę streptozotocyny. Do dalszego etapu doświadczenia zakwalifikowano myszy, u których przed przeszczepieniem wysp Langerhansa w dwóch kolejnych badaniach glikemia przekraczała 350 mg%.
W celu zapobiegnięcia odrzuceniu przeszczepionych wysp zamiast niebezpiecznego leczenia immunosupresyjnego zastosowano ich opłaszczenie metodą Sun´a.
W badaniach zastosowano model przeszczepiania w układzie ksenogenicznym, heterotopowym, wstrzykując do jamy otrzewnowej myszy opłaszczone wyspy pozyskane z trzustki szczura. Materiał został podzielony na następujące grupy:
A. Grupy kontrolne:
1. Grupa (KZ) 50 zdrowych myszy.
2. Grupa (KC) 50 myszy z cukrzycą streptozotocynową. Badania morfologiczne przeprowadzano na zwierzętach z obu grup w 6, 9, 12, 15, 18 miesiącu życia.
B. Grupy doświadczalne:
1. Grupa (TxW) 40 myszy, którym wyspy przeszczepiono zaraz po wywołaniu cukrzycy (przeszczepienie wczesne).
Transplantacje wysp wykonywano w:
GRUPA (TW) w wieku około 3 miesięcy (14-16 tyg.) życia.
Badania morfologiczne przeprowadzano na zwierzętach z grupy TW w 6, 9, 12, 18 miesiącu życia.
2. Grupa (TxP) 30 myszy, którym wyspy przeszczepiono po 3 miesiącach trwania cukrzycy (przeszczepienie późne).
Transplantacje wysp wykonywano w:
GRUPA (TP) w wieku około 6 miesięcy życia.
Badania morfologiczne przeprowadzano na zwierzętach z grupy TP w 9, 12, 18 miesiącu życia.
Zwierzęta były zabijane przez przemieszczenia rdzenia kręgowego zgodnie z zaleceniami Krajowej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach (1). Gałki oczne bezpośrednio po pobraniu rozcinano wzdłuż płaszczyzny równikowej, a następnie część zawierającą siatkówkę utrwalano przez 20 minut w 3% roztworze aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Po wstępnym utrwaleniu materiał był dzielony pod mikroskopem na fragmenty wielkości 3 mm3 tak, aby wybrać fragmenty ze środkowej części siatkówki.
Zatopiony materiał był cięty za pomocą ultramikrotomu na skrawki, które analizowano następnie za pomocą mikroskopu elektronowego. Elektronogramy siatkówki uzyskiwano za pomocą mikroskopu elektronowego JEM 100C (Jeol). Wpływ transplantacji na przebieg retinopatii badano porównując obrazy histologiczne naczyń siatkówek w odpowiednich grupach zwierząt. W badaniach przeprowadzono pomiary naczyń w warstwach siatkówki położonych pomiędzy warstwą jądrową zewnętrzną, a splotowatą wewnętrzną siatkówki.
Przy użyciu mikroskopu elektronowego dokonano analizy morfometrycznej stanu naczyń i zmian dotyczących grubości błon podstawnych siatkówki oraz zmian w nabłonku barwnikowym. Zdjęcia przenoszono do komputera za pomocą skanera, a następnie poddawano analizie programem Image-ProPlusTM. U każdej myszy mierzono grubości błony podstawnej w 20 losowo wybranych naczyniach (po 10 w każdym oku). Pomiarów dokonywano na błonach podstawnych komórek śródbłonka leżących w krótkiej osi elipsy wyznaczającej przekrój naczynia. W ten sposób minimalizowano błąd wynikający ze skośnego przebiegu przekrojów.
Analizę statystyczną obejmującą określenie zależności pomiędzy wiekiem zwierząt a grubością błony podstawnej przeprowadzono za pomocą testu Spearmana, osobno dla każdej z badanych grup. W pierwszym etapie efekt analizy wpływu cukrzycy na grubość błon podstawnych siatkówki porównano z grupą zwierząt zdrowych (KZ) i chorych na cukrzycę (KC). Analiza obejmowała zwierzęta w wieku 6, 9 12, 15 i 18 miesięcy. Analizę zwierząt z przeszczepami wczesnymi i późnymi wysp trzustkowych przeprowadzono z uwzględnieniem zwierząt 9-, 12-, i 18-miesięcznych. Dodatkowo w grupie leczonej przeszczepami wczesnymi (TxW) przeprowadzono analizę grubości błon podstawnych naczyń siatkówki u zwierząt po 3 miesiącach od przeszczepu (czyli w wieku 6 miesięcy). Analizę statystyczną przeprowadzono z zastosowaniem ANOVA, model mieszany analiza wariancji z ustalonym efektem – deterministycznym oraz efektem losowym – stochastycznym (modele GML). Uzyskane kontrasty (różnice pomiędzy grupami) oceniano następnie testem Tuckeya.
Przywrócenie normoglikemii w grupach TxW i TxP potwierdziły działanie przeszczepu. Tylko w 9% pomimo kolejnego doszczepienia nie uzyskano normoglikemii. W grupie TxW powtórne doszczepienie najpóźniej wykonywano w 12 miesiącu po przeszczepie, a w grupie TxP w 8 miesiącu. We wszystkich badanych grupach (KZ, KC, TxW i TxP) analiza uzyskanych wyników wykazała, iż grubość błony podstawnej wzrasta wraz z wiekiem zwierząt. Korelacja pomiędzy wiekiem myszy a grubością błon podstawnych jest największa w przypadku zwierząt zdrowych (Spearman R=0,62). Wskazuje to na fakt, iż proces pogrubiania się błon podstawnych naczyń włosowatych jest naturalnym zjawiskiem będącym elementem procesu starzenia się organizmu. W przypadku zwierząt z wyindukowaną cukrzycą, również obserwowano korelację pomiędzy wiekiem a grubością błon podstawnych (Spearman R=0,52). Proces pogrubiania się błon podstawnych postępował w tej grupie szybciej niż w grupie kontrolnej (ANOVA p<0,001). Średnia grubość u najstarszych zwierząt z cukrzycą była o prawie 30% większa niż w przypadku zwierząt zdrowych w tym samym wieku. W badanym materiale zmiany te występowały nieco wcześniej niż opisywali to inni badacze. Powodem tego może być fakt, iż w przeprowadzonych badaniach zawężono analizę do kilku wybranych warstw siatkówki co powoduje uzyskanie bardziej spójnych wyników. Grubości błon podstawnych są różne w zależności od warstwy siatkówki. Różnice w grubości błon podstawnych pomiędzy zwierzętami zdrowymi i chorymi pojawiły się już w 3 miesiące od wywołania cukrzycy (czyli u zwierząt w wieku 6 miesięcy), co wskazuje na dużą dynamikę obserwowanych zmian. Różnica w grubości błon podstawnych pomiędzy zwierzętami chorymi i zdrowymi wzrastała wraz z czasem trwania cukrzycy. W obrazie morfologicznym naczyń nie stwierdzono obserwowanego u pacjentów z cukrzycą zjawiska zwielokrotniania błon podstawnych.
Obok pogrubienia błon podstawnych naczyń włosowatych siatkówki, charakterystyczną dla obrazu morfologicznego siatkówek zwierząt z cukrzycą były zmiany w obrębie nabłonka barwnikowego. Występowanie powyżej opisanych zmian było zależne od czasu trwania cukrzycy. Pierwsze zauważalne zmiany w morfologii nabłonka barwnikowego obserwowano u zwierząt w 6 miesiącu trwania cukrzycy, a więc później niż zmiany grubości błon podstawnych naczyń włosowatych. W komórkach tych obserwowano dezorganizację labiryntu podstawnego, objawiającą się spłyceniem wgłobień błon komórkowych w części podstawnej nabłonka. Wgłobienia te zatracały swoją regularność, przez co ulegała zmniejszaniu powierzchnia wymiany pomiędzy naczyniówką, a warstwą komórek nabłonka barwnikowego. Zmniejszona wymiana gazów jak i czynników odżywczych jest powodem zaburzeń w funkcjonowaniu czopków i pręcików, a tym samym prowadzi do zaburzeń widzenia. Dodatkowo u zwierząt u których cukrzyca trwała ponad rok obserwowano odkładanie się słabo pochłaniającego elektrony, amorficznego materiału pomiędzy błoną Brucha, a częścią podstawną komórek barwnikowych. Obraz ten może odpowiadać druzom opisywanym w przypadku zmian morfologicznych związanych z procesem starzenia się. Wypełnienie tej przestrzeni złogami może dodatkowo ograniczać transport pomiędzy błoną naczyniową a siatkówką.
W grupach zwierząt leczonych eksperymentalnymi przeszczepami wysp trzustkowych obraz morfologiczny siatkówek był podobny jak w przypadku grupy zwierząt zdrowych. W grupach tych nie obserwowano znaczących zmian w obrębie nabłonka barwnikowego.
Pomiary grubości błon podstawnych naczyń włosowatych zewnętrznych warstw siatkówki w grupach myszy leczonych ksenogenicznymi przeszczepami opłaszczonych wysp trzustkowych wykazały skuteczność takiej terapii zarówno w przypadku wykonywania przeszczepiania w początkowym okresie cukrzycy jak i w 3 miesiące później (p<0,001). W obu przypadkach zarejestrowano spowolnienie procesu pogrubiania się błon podstawnych w porównaniu do zwierząt nie leczonych (p<0,001). W przypadku przeszczepień wczesnych analiza wykazała iż grubości tych błon są mniejsze niż w przypadku przeszczepień późnych (p<0,001), jednak w żadnej z badanych grup nie stwierdzono cofania się zmian patologicznych pod wpływem zastosowanej terapii, o czym świadczy fakt, iż we wszystkich badanych grupach stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy wiekiem a grubością badanych błon podstawnych. Dla grup zwierząt z przeszczepami późnymi korelacja ta była najmniejsza, co można tłumaczyć dużymi rozrzutami wartości w tej grupie.
Uzyskane wyniki wskazują, iż zastosowana metoda leczenia może częściowo ograniczyć szybkość powstawania zmian w obrębie błon podstawnych, ale nie jest w stanie ich odwrócić. Jest to zgodne z wynikami prac Ar´Rajab´a, który stwierdził obniżenie poziomu glikemii i zapobieganie powikłaniom oczno-nerkowym po przeszczepieniu świeżych wysp (obserwacja 3-miesięczna) i Cuthbertson´a po przeszczepieniu hodowanych in vitro trzustek płodowych pod torebkę nerki (obserwacja 18-miesięczna) (2, 3). Również Chakrabarti wykazał w 14-miesięcznej obserwacji, że u myszy z cukrzycą allotransplantacja wysp, skutecznie zapobiega degeneracji i utracie perycytów w kapilarach siatkówki (4). Zgrubienia błon podstawnych, które powstają w okresie hiperglikemii powiększają się z wiekiem ale szybkość tych zmian jest ograniczona. Wynika z tego, iż efekt leczenia immunoizolowanymi przeszczepami ksenogenicznych wysp trzustkowych zależy od momentu rozpoczęcia terapii. Sima opublikował 400-dniowe obserwacje zatrzymania progresji pogrubienia błon podstawnych w naczyniach siatkówki po allotransplantacji wysp u szczurów. Jednak nie można porównać do końca prac dotychczas opublikowanych z przedstawionym doświadczeniem, ponieważ dotyczyły one przeszczepów trzustki lub wysp w modelu auto lub allogenicznym, a także nie uwzględniały czasu wykonania przeszczepienia.
Efekt terapii mierzony ograniczeniem patologii błon podstawnych naczyń włosowatych siatkówki, jest tym lepszy im wcześniej rozpoczęto leczenie. Co ważne, w grupach leczonych przeszczepami wysp trzustkowych nie stwierdzono występowania zmian morfologicznych dotyczących nabłonka barwnikowego.
Przeprowadzony eksperyment dowiódł, że wczesne wykonanie przeszczepienia opłaszczonych wysp Langerhansa zmniejsza ryzyko powstania retinopatii cukrzycowej, po przeszczepieniach późnych progresja retionopatii uległa znacznemu zmniejszeniu lecz nie cofały się zmiany, które wystąpiły przed przeszczepieniem.
Wnioski: 1. U myszy z cukrzycą przeszczepienie wysp Langerhansa hamuje rozwój zmian patologicznych błon podstawnych naczyń siatkówki. 2. U zwierząt z cukrzycą leczonych przeszczepieniem wysp trzustkowych nie obserwowano cofania się, a jedynie stabilizację już powstałych zmian patologicznych w obrębie błon podstawnych naczyń siatkówki. 3. Przeszczepienie wysp trzustkowych zapobiega powstawaniu zmian w obrębie nabłonka barwnikowego siatkówki. Dotyczy to zarówno przeszczepów wykonywanych natychmiast, jak i w trzy miesiące po wywołaniu cukrzycy.

Summary
One of the most serious problem in patients with Type-1 diabetes are changes in retinal microcirculation which lead at last to serous complications. In spite of correct diabetic patient management retinopathy symptoms occur after approximately five years from diseases onset. Diabetic microangiopathy leads to sight degradation and blindness subsequently even with continuous ophthalmology treatment.
Aims: Answer the question: Can we stop regression of diabetic retinopathy after Langerhans cells transplantation?
Method: In trials BALBC mice aged 14-16 weeks with induced streptozotocinic diabetes have been used. Immediately after induced diabetes [TxW] and after 3 month diabetes [TxP] immunoisolated Langerhans islets taken from WAG rats have been injected mice intraperitonaly. Controls were age-matched no diabetic and diabetic untreated mice. Collected material (eyes) were preparing to analysis. Vessels and retinal pigment epithelium have been analyzed using electron microscopy.
Results: Mice grafted early after the induction of diabetes had normal BMT (basement membrane thickness) and RPE (retinal pigment epithelium). In each case the late- transplanted mice had BMT significantly more and RPE changes then no diabetic ; thickness didn´t changed during time.
Conclusions: 1. Langerhans cells transplantation brake degenerations of BMT but results are statistical better in early transplantations. 2. We didn´t observe withdrawal of changes at retina after Langerhans cells transplantation. 3. Langerhans cells transplantation prevent RPE changes at early and late transplantation.