Wapń stanowi nie tylko ważny składnik tkanek podporowych, pełni funkcję regulatora stanu wrażliwości komórek nerwowych i aktywności enzymów śródkomórkowych, ale również uczestniczy w mechanizmie skurczu mięśni szkieletowych i gładkich, w utrzymywaniu stabilności cytoszkieletu komórkowego, w zjawiskach wzrostu i różnicowania komórek, jak również w procesach odporności komórkowozależnej, krzepnięcia i fibrynolizy. Z gospodarką wapniową ściśle powiązany jest metabolizm fosforu, odgrywający kluczową rolę nie tylko w budowie kośćca, ale również w budowie kwasów nukleinowych, w tworzeniu związków wysokoenergetycznych, fosfolipidów błon komórkowych i struktur subkomórkowych (mitochondria, lizosomy, mikrosomy) oraz w procesach glikolizy i glikoneogenezy oraz przenoszenia tlenu przez hemoglobinę. Stężenie fosforanów należy do głównych czynników regulacji sekrecji parathormonu i 1,25-dihydroksywitaminy D oraz wpływa bezpośrednio lub pośrednio na kalcemię oddziaływując na inne hormony (białko Klotho, fosfatoniny) regulacji gospodarki wapniowo-fosforanowej. Koncertowe współdziałanie kluczowych graczy gospodarki wapniowo-fosforanowej zabezpiecza precyzyjne mechanizmy regulacji stężenia wapnia i fosforanów zarówno w środowisku śródkomórkowym, jak i pozakomórkowym.

Treścią niniejszej pracy (podzielonej ze względu na dużą objętość na dwie części) jest przedstawienie postępów w badaniach nad molekularnymi zaburzeniami gospodarki wapniowo-fosforanowej. W części pierwszej omówione zostaną zaburzenia gospodarki wapniowo-fosforanowej uwarunkowane zmienioną strukturą lub funkcją parathormonu (PTH), białka PTH-podobnego (PTHrP) lub receptorów wymienionych hormonów, receptora witaminy D, a także uwarunkowane zaburzeniami gospodarki fosforanowej (w szczególności działaniem fosfatonin).

W części drugiej omówione będą zaburzenia uwarunkowane zmianami strukturalno/czynnościowymi receptora wapniowego (Ca-SR), zaburzeniami układu RANK/RANKL/osteoprotegeryna, zaburzeniami sekrecji białka Klotho oraz fetuiny A.

PTH jest linearnym polipeptydem zawierającym 84 aminokwasy (PTH-1-84). Prekursorem PTH-1-84 jest polipeptyd prepro-PTH złożony z 115 aminokwasów. Gen kodujący prepro-PTH zlokalizowany jest na chromosomie 11 (11p15). Miejscem syntezy PTH są przytarczyce wydzielające przeważnie cząsteczki PTH-1-84, chociaż w stanach chorobowych przebiegających z hiperkalcemią wydzielane są również fragmenty PTH pozbawione kilku aminokwasów N-końcowych. Około 10-20% krążących we krwi cząsteczek PTH to z PTH-1-84, natomiast pozostałe cząsteczki to N- lub C-końcowe fragmenty cząsteczek PTH-1-84. Okres półtrwania PTH-1-84 wynosi 2-5 minut. Cząsteczki PTH-1-84 wychwytywane są przez komórki osi osteoblasto-osteoklastycznej, hepatocyty i nerki. W wątrobie wszystkie wychwycone cząsteczki PTH-1-84 lub N-końcowe fragmenty tego hormonu ulegają degradacji do fragmentów pozbawionych aminokwasów N-końcowych. Część tych fragmentów wydzielana jest do krwi. Okres półtrwania C-końcowych fragmentów PTH jest 5-10-krotnie dłuższy od okresu półtrwania PTH-1-84. W nerkach przesączone w kłębuszkach nerkowych cząsteczki PTH ulegają resorpcji przez komórki cewek proksymalnych wiążąc się z receptorem PTH-R-1 lub ulegając internalizacji szlakiem endocytozy megalinowo-kubulinowej (1, 2, 3).

Trzecim narządem klirensującym PTH-1-84 są kości, gdzie PTH jest ważnym regulatorem aktywności osi osteoblasto-osteoklastycznej.

Do niedawna błędnie uważano, że przez oznaczenie tzw. intact PTH zestawami drugiej generacji oznacza się tylko stężenie cząsteczek PTH-1-84. Okazało się jednak, że używane w tych zestawach przeciwciała anty-PTH rozpoznają nie tylko cząsteczki PTH-1-84, ale również jego fragmenty pozbawione pierwszych 6 N-końcowych aminokwasów. Ponieważ aktywność biologiczna PTH zależna jest od N-końcowego fragmentu PTH złożonego z 34 aminokwasów, wprowadzono do diagnostyki paratyreologicznej zestawy trzeciej generacji umożliwiające oznaczanie stężenia PTH-1-84 i biologicznie aktywnych N-końcowych fragmentów tego hormonu (cząsteczki te aktywują cyklazę adenylanową i dlatego określono je skrótem CAP – cyclase activating PTH) oraz C-końcowych fragmentów pozbawionych pierwszych 6 N-końcowych aminokwasów i nie wykazujących wpływu na cyklazę adenylanową. Te ostatnie C-końcowe fragmenty PTH określono skrótem CIP (cyclase inactive PTH). Wkrótce okazało się, że C-końcowe fragmenty PTH (PTH-7-84) początkowo uważanie za biologicznie nieaktywne posiadają swoisty receptor, oraz że aktywacja tego receptora wywołuje spadek kalcemii, hamuje resorpcję kości i zmniejsza fosfaturię, tj. wywołuje efekty biologiczne antagonistyczne do tych, które obserwowane są po zadziałaniu PTH-1-84 lub PTH-1-34 na receptor PTH-R-1. Aktywacja tego receptora wywołuje hiperkalcemię, nasila fosfaturię i resorpcję kości (4, 5, 6, 7). Jak dotąd nie rozstrzygnięto jednoznacznie korzyści diagnostycznej oznaczania CAP i CIP.

Dotychczas zidentyfikowano trzy receptory dla PTH. Pierwszy z nich jest wspólnym receptorem dla PTH i PTHrP i określany jest skrótem PTH-1-R (8). Receptor ten wiąże cząsteczki PTH-1-84, PTH-1-34 i N-końcowe fragmenty PTHrP, nie wiąże natomiast cząsteczek PTH-7-84. Aktywacja tego receptora uruchamia szlak sygnalizacyjny cyklaza adenylanowa-cAMP lub fosfolipazy C (typ I receptora PTH-1-R) lub tylko fosfolipazy (typ II receptora PTH-1-R).

Drugim receptorem dla PTH jest receptor PTH-2-R. Do niedawna uważano, że receptor ten swoiście wiąże cząsteczki PTH-1-84. Okazało się, że swoistym ligandem dla tego receptora jest polipeptyd tkanki mózgowej złożony z 39 aminokwasów określony skrótem TIP 39 (tubero-infundibular peptide). Receptor ten wiąże cząsteczki PTH-1-84 i PTH-1-34, nie wiąże natomiast cząsteczek PTHrP.

Trzecim receptorem dla PTH jest receptor określany skrótem C-PTH-R. Receptor ten wiąże cząsteczki PTH-7-84, PTH-19-84 oraz PTH-1-84 (6).

Ponadto zidentyfikowano istnienie u pewnych ryb receptora określanego skrótem zPTH-3R (z = zebra fish). Znaczenie tego receptora u człowieka jest nieznane.

PTH należy do głównych czynników regulujących gospodarkę wapniowo-fosforanową. Hormon ten stymuluje syntezę 1,25(OH)₂D, w nerkach, resorpcję zwrotną Ca w cewkach nerkowych oraz nasila fosfaturię blokując kotransporter sodowo-fosforanowy typu IIa. Na poziomie krwi działanie PTH wyraża się wzrostem kalcemii i spadkiem fosfatemii.

Głównymi regulatorami sekrecji PTH przez przytarczyczki są kalcemia, fosfatemia i stężenie 1,25(OH)₂D w osoczu krwi. Hipokalcemia, hiperfosfatemia i niedobór 1,25(OH)₂D pobudzają sekrecję PTH, natomiast hiperkalcemia, hipofosfatemia i nadmiar 1,25(OH)₂D wykazuje działanie przeciwne tj. zmniejszają sekrecję PTH.

Drugim hormonem kalcytropowym jest hormon PTH-podobny (PTHrP) wykazujący z PTH-1-84 wspólny receptor PTH-1-R. PTHrP jest produktem oddzielnego genu, którego produktem jest pro-polipeptyd złożony z 173 aminokwasów (9). Aktywny fragment tego polipeptydu składa się z 139 aminokwasów. Ten ostatni jest polihormonem, przy czym fragment PTHrP-1-36 wykazuje działanie PTH-podobne, zaś fragment PTHrP-38-94 wpływa na przezłożyskowy transport wapnia. Fragment PTHrP-107-139 wykazuje hamujący wpływ na resorpcję kości. PTHrP-1-139 jest więc polihormonem wykazującym wpływ na proliferację, różnicowanie i apoptozę komórek mezenchymalnych, nabłonkowych, endokrynnych, nerwowych i łożyskowych. Chociaż działanie PTHrP ma charakter głównie parakrynny, jukstakrynny lub intrakrynny, to w określonych stanach chorobowych (głównie w nowotworach) może być przyczyną hiperkalcemii, spowodowanej działaniem systemowym tego hormonu (9).

Zmieniona struktura PTH, nierozpoznana przez receptor PTH-1-R jest przyczyną niedoczynności przytarczyc spowodowanej niewystępowaniem aktywacji szlaku sygnalizacyjnego cyklaza adenylanowa-cAMP. W konsekwencji rozwija się hipokalcemia (spowodowana zmniejszoną mobilizacją wapnia z kości i zmniejszonym wchłanianiem wapnia z przewodu pokarmowego uwarunkowanym zmniejszoną biosyntezą 1,25(OH)₂D₃) oraz hiperfosfatemią (3).

Zwiększona nadprodukcja PTH może być spowodowana mutacją inaktywującą supresorów nowotworowych (menina, białko p53, białko retinoblastomowe Rb), mutacjami aktywującymi proto-onkogenów (cyklina, RET), mutacją inaktywującą receptora wapniowego (patrz niżej – hiperkalcemia hipokalciuryczna, zespół ciężkiej nadczynności przytarczyc u noworodków) lub mutację inaktywującą receptora PTH-1-R. Ta ostatnia opisana, znana jako zespół Bloomstranda, charakteryzuje się brakiem wzrostu cAMP i inozytolo-trifosforanu po podaniu PTH lub PTHrP oraz zwiększonym dojrzewaniem śródchrzęstnym kości w życiu płodowym. Nadczynność przytarczyc może również stanowić jeden z objawów zespołu endokrynopatii wielogruczołowej MEN1 i MEN2 i zespołu HPT-JT (hyperparathyroidism-jaw tumor syndrome). Zarówno w sporadycznym raku przytarczyc, jak i w zespole HPT-JT często stwierdza się mutację inaktywującą genu HRPT2 kodującego parafibrominę (3-10).

Mutacja inaktywująca receptora PTH-1-R może być przyczyną rzekomej niedoczynności przytarczyc. Wyróżnia się następujące typy rzekomej niedoczynności przytarczyc (11):

– Typ Ia.W stanach fizjologicznych PTH wiążąc się z PTH-1-R działa na białko Gs wiążące nukleotydy guaninowe. W następstwie tej reakcji dochodzi do aktywacji cyklazy adenylanowej i uwalniania cAMP będącego mediatorem działania PTH na komórki. Białko G_s składa się z trzech podjednostek α, β i γ. W typie Ia rzekomej niedoczynności stwierdza się mutację inaktywującą genu GNASI kodującego łańcuch G_sα warunkującą oporność receptora PTH-1-R na działanie PTH-1-84 i manifestującą się klinicznie jako zespół Albrighta (mały wzrost, upośledzenie umysłowe, hipokalcemia, hiperfosfatemia, brak wzrostu, wydalanie cAMP po podaniu egzogennego PTH-1-84, duże stężenie PTH we krwi).

– W typie Ib rzekomej niedoczynności przytarczyc stwierdza się profil biochemiczny w osoczu podobny do występującego w typie Ia, różni się natomiast występowanie prawidłowego wzrostu i prawidłową reakcją receptora PTH-1-R na podanie PTHrP przy braku reakcji po podaniu PTH-1-84. Choroba może być spowodowana defektem metylacji zmutowanego genu GNASI. W odróżnieniu od typu Ia w typie Ib nie stwierdza się oporności receptorów dla TSH, glukagonu i gonadotropin.

– W typie Ic obraz kliniczny i profil biochemiczny nie różnią się od typu Ia, ale aktywność G_sα jest prawidłowa.

– W typie II rzekomej niedoczynności stwierdza się prawidłowy wzrost wydalania cAMP, ale nie fosforanów z moczem po podaniu PTH-1-84. Ponadto stwierdza się prawidłowy wzrost, niewystępowanie anomalii szkieletowych typowych dla zespołu Albrighta oraz prawidłową reakcję receptorów dla TSH, glukagonu i gonadotropin po podaniu tych hormonów. Przyczyna choroby nie jest znana.

– W rzekomo-rzekomej niedoczynności przytarczyc stwierdza się fenotyp choroby Albrighta i mutację genu dla białka G_sα. Pomimo tego nie stwierdza się profilu hormonalnego rzekomej niedoczynności przytarczyc typu Ia. Jeżeli chory dziedziczy zmutowany gen od ojca, chory wykazuje obraz kliniczny zespołu rzekomo – rzekomej niedoczynności przytarczyc, natomiast w razie dziedziczenia tego genu od matki stwierdza się obraz kliniczny niedoczynności przytarczyc.

Bardzo rzadko spotykaną mutacją aktywującą receptora PTH-1-R jest zespół karłowatości Jansena (spowodowany mutacjami typu missense H223R, T410P lub I458R) manifestującego się hiperkalcemią, hipofosfatemią i prawidłowym lub małym stężeniem PTH i PTHrP (12).

Receptor witaminy D (Vitamin D receptor, VDR) został odkryty w połowie lat 70. ubiegłego wieku. Należy on do „rodziny” receptorów jądrowych, aktywowanych przez hormony steroidowe i działa jako aktywowany ligandem czynnik transkrypcyjny. Kontrola transkrypcji genów zależnych od witaminy D (tab. 1) odbywa się w kilku etapach. Najpierw receptor musi związać się z ligandem poprzez odpowiednią domenę wiążącą. Na skutek tego zachodzi heterodimeryzacja receptora z receptorem RXR (retinoid X receptor), co powoduje zmiany konformacji przestrzennej receptora. W efekcie heterodimery wiążą się z odpowiednimi miejscami (elementy zależne od witaminy D – vitamin D responsive elements) promotorów genów zależnych od witaminy D i z różnymi jądrowymi białkami koregulatorowymi. Klasycznie rozróżniano dwa ich typy – białka zwiększające lub hamujące transkrypcję aktywowaną przez VDR (koaktywatory i korepresory). Ostatnio jednak odkryto, że w zależności od rodzaju komórki niektóre białka mogą pełnić obie te funkcje (komodulatory; np. białko NCoA62/Skip). Za wiązanie białek koregulatorowych opowiedzialne są przede wszystkim dwie domeny receptora VDR (odpowiedzialna za heterodimeryzację i AF2), których unieczynnienie powoduje znaczne zmniejszenie aktywności transkrypcyjnej aktywowanej przez VDR. Białka represorowe mogą działać na przykład przez aktywację deacetylazy histonowej (deacetylującej reszty lizynowe), co powoduje spakowanie chromatyny jądrowej i zahamowanie ekspresji genu (14).

Oprócz białek regulatorowych wyróżnia się jeszcze swoiste dla danego typu komórki białka zmieniające szybkość asocjacji/dysocjacji kompleksu ligand/VDR wewnątrz komórki (intracellular vitamin D binding/interacting proteins – IDBP), mogące w ten sposób wpływać na zależną od liganda aktywację VDR (14).

Jak widać w tabeli 1, gama genów regulowanych przez VDR w prawidłowych komórkach jest dość szeroka (w komórkach nowotworowych VDR reguluje ich znacznie więcej). Następstwem tego jest plejotropowość działania witaminy D. Wpływa ona przede wszystkim na gospodarkę wapniowo-fosforanową, działając w przewodzie pokarmowym (głównie pobudzając wchłanianie wapnia i fosforanów), układzie kostnym (gra rolę w procesach jego rozwoju, w „dorosłym” szkielecie pobudza obrót kostny), nerkach (zwiększając wchłanianie zwrotne wapnia), przytarczycach (hamując wydzielanie PTH). Wywierać jednak może również działanie antyproliferacyjne i wpływać (zarówno hamująco, jak i aktywująco) na apoptozę komórek, co może powodować przeciwnowotworowe efekty witaminy D, opisywane szczególnie w nowotworach jelita grubego, sutka i gruczołu sterczowego. Moduluje ona także odpowiedź immunologiczną i przeciwzapalną ustroju (być może uczestnicząc w patogenezie chorób z autoagresji), bierze udział w regulacji rozwoju i funkcji skóry i włosów, wpływa na czynność mięśni szkieletowych, wreszcie moduluje funkcję układu RAA i wpływa na naczynia krwionośne i ciśnienie tętnicze (13, 14, 15).

Warto wspomnieć, że oprócz działania na swoje receptory 1,25(OH)₂D₃ może również wywierać działania pozagenomowe (pozareceptorowe). Efekty wywierane tą drogą są o wiele szybsze niż działanie poprzez receptor jądrowy (należy do nich m.in. aktywacja PKC i MAPK, cyklazy guanylanowej, otwarcie kanałów chlorkowych, stymulacja napływu Ca do cytozolu). Mimo wielu badań wciąż kontrowersyjna jest kwestia, w jaki sposób efekty te zachodzą (13). Wydaje się, że mogą one przynajmniej częściowo być wynikiem pobudzenia receptorów błonowych (membrane-associated, rapid-response steroid-binding receptor: 1,25D3-MARRS, anneksyna II).

Jak wynika z powyższego, zaburzenia działania VDR mogą być powodowane nie tylko przez uwarunkowane genetycznie zmiany jego struktury i funkcji, ale możliwe są także na skutek zmian struktury i funkcji różnych białek uczestniczących w jego działaniu. Możliwe są także izoformy VDR powstałe w wyniku alternatywnego składania (splicing), np. izoforma B1 o zwiększonej aktywności transkrypcyjnej (16) oraz potranslacyjne jego modyfikacje.

Najważniejszą i najlepiej opisaną chorobą wynikającą z zaburzeń receptora VDR jest krzywica witamino-D-oporna typu II. Jej przyczyną są mutacje genu kodującego VDR zlokalizowane w domenie wiążącej DNA, w tzw. motywie „palca cynkowego”, a także w domenie wiążącej hormon (np. C140A, C970A, R271L), prowadzące, do zmniejszonego powinowactwa receptora do hormonu. Obraz kliniczny jest podobny jak w krzywicy niedoborowej, jednak stężenie 1,25(OH)₂ witaminy D w surowicy jest wysokie, a chorzy słabo lub w ogóle nie reagują na leczenie substytucyjne, prowadzone zwykle bardzo dużymi dawkami kalcytriolu. U niektórych chorych występuje alopecia totalis, ujawniająca się zwykle w pierwszych dwóch latach życia).

Krzywica witamino-D-oporna typu I jest spowodowana mutacjami genu kodującego 1-alfa-hydroksylazę i reaguje dobrze na leczenie pochodnymi witaminy D hydroksylowanymi w pozycji 1-alfa.

Opisano również wiele polimorfizmów VDR, z czego przynajmniej kilka może wpływać na jego czynność. Mogą one mieć związek z gęstością mineralną kości, opornością na leczenie witaminą D oraz podatnością na zakażenia, choroby z autoagresji i na niektóre typy nowotworów. Ostatnio opisywano także związek niektórych polimorfizmów VDR z chorobami układu sercowo-naczyniowego.

Fosfor stanowi ważne ogniwo regulacji przemian śródkomórkowych, będąc nośnikiem energetycznym uczestniczącym w procesach energotwórczych, strukturach kwasów DNA i RNA, jak również w zjawiskach sygnalizacyjnych różnych szlaków metabolicznych. Uczestniczy też w podtrzymaniu integralności morfologicznej i czynnościowej układu ruchu.

Fosfatemia zależna jest od wielkości podaży Pi (fosforanów nieorganicznych) w pokarmach oraz ich wchłaniania, stopnia mobilizacji lub odkładania Pi w kościach i innych tkankach, od przemieszczenia Pi z przestrzeni pozakomórkowej do śródkomórkowej i odwrotnie, oraz od stopnia wydalania Pi z moczem i (w niewielkim stopniu) z kałem. Czynnikami zwiększającymi wchłanianie Pi z przewodu pokarmowego do krwi i z płynu cewki nerkowej do płynu śródmiąższowego i dalej do krwi jest 1,25(OH)₂D. Proces wchłaniania Pi w przewodzie pokarmowym i w cewkach nerkowych zachodzi za pośrednictwem kotransportera Na/Pi-IIa, zależnego nie tylko od witaminy D (17), ale także od wielu innych czynników hormonalnych (np. PTH, ANP, NO) i niehormonalnych, takich jak kinaza białek A, C, G, kinaza pozakomórkowa receptora ERK-1/2 (18, 19). Proces ten jest zależny również od trzech niedawno poznanych substancji fosfaturycznych tj. czynnika wzrostowego fibroblastów 23 (FGF23), białka FRP-4 (frizzled related protein) i MEPE (matrix extracellular phosphoglycoprotein) oraz ulega zaburzeniom w razie defektu kotransportera Na/Pi IIa (20, 21, 22, 23).

Stężenie Pi w surowicy obniżają takie czynniki, jak alkaloza, glikemia w obecności insuliny, adrenalina i wstrząs septyczny, natomiast podwyższają je kwasice (20).