© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 7-8/2007, s. 276-281
*Anna Ejduk1, Mirosław Majewski1, Ilona Seferyńska1, Grażyna Pałynyczko2,
Barbara Pieńkowska-Grela3, Krzysztof Warzocha1
Znaczenie prognostyczne kompleksowej diagnostyki genetycznej u chorych na ostre białaczki szpikowe*
Prognostic significance of complex genetic diagnostics in patients with acute myeloid leukemia
1Klinika Hematologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Krzysztof Warzocha
2Klinika Chorób Wewnętrznych i Hematologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
kierownik Kliniki: prof. dr hab. n. med. Lech Konopka
3Samodzielna Pracownia Cytogenetyki Centrum Onkologii – Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie
kierownik Pracowni: dr n. med. Barbara Pieńkowska-Grela
Streszczenie
Wstęp. Stwierdzenie aberracji genetycznych w momencie rozpoznania ostrej białaczki szpikowej (OBS) dostarcza ważnych informacji rokowniczych i wpływa na wybór leczenia.
Materiały i metody. Przedmiotem badań była kompleksowa diagnostyka genetyczna u 63 chorych z OBS w oparciu o kariotyp i badania molekularne genów fuzyjnych AML1-ETO, CBFB-MYH11 i PML-RARA zgodnie z protokołem BIOMED-1, celem oceny przydatności tych metod w stratyfikacji chorych do określonych grup rokowniczych w czasie rozpoznania.
Wyniki. Aberracje genetyczne wykryto u 31 chorych (49,2%). U 6 z 63 badanych chorych (9,5%) nie uzyskano metafaz do analizy cytogenetycznej. Aberracje genetyczne stratyfikujące do grupy niskiego ryzyka cytogenetycznego wykryto u 18 chorych (28,5%). W tej grupie chorych, analiza kariotypu pozwoliła na wykrycie dobrze rokujących aberracji u 12 pacjentów (66,7%), a jednoczesna analiza molekularna dodatkowo u 6 chorych (33,3%). Prawidłowy kariotyp lub aberracje stratyfikujące chorych do grupy pośredniego ryzyka cytogenetycznego stwierdzono u 30 pacjentów (47,6%). Analiza kariotypu wykazała złożone zaburzenia genetyczne lub aberracje stratyfikujące do grupy wysokiego ryzyka cytogenetycznego u 13 chorych (20,6%). Odsetek całkowitych remisji (CR) był zależny od ryzyka genetycznego i wynosił 72,2% w grupie niskiego, 53,2% w grupie pośredniego i 15,3% w grupie wysokiego ryzyka. Mediana całkowitego czasu przeżycia chorych nie została osiągnięta w grupie niskiego ryzyka i wynosiła odpowiednio 449 oraz 135 dni w grupie pośredniego i wysokiego ryzyka.
Wnioski. Diagnostyka genetyczna u chorych z OBS w oparciu o kariotyp i badania molekularne genów fuzyjnych pozwala na kompleksową ocenę ryzyka choroby, która nie jest możliwa przy wyłącznym stosowaniu metod cytogenetycznych lub molekularnych.
Summary
Introduction. Determination of chromosomal aberrations in acute myeloid leukemia (AML) is an important factor that helps to select an appropriate treatment schedule.
Materials and methods. The aim of this study was to perform complex genetic diagnostics in 63 AML patients, based on karyotyping and molecular tests for the presence of fusion genes AML1-ETO, CBFB-MYH11 and PML-RARA according to BIOMED-1 protocol, to reveal its usefulness in stratification of patients into different risk groups at the time of diagnosis.
Results. Chromosomal aberrations were detected in 31 patients (49.2%). In six patients (9.5%), classical cytogenetics was not performed due to lack of metaphases. Genetic aberrations allowing stratification into the low risk group were detected in 18 patients (28.5%). In this group, cytogenetics revealed chromosomal aberrations in 12 patients (66.7%) and molecular tests detected fusion genes in 6 other patients (33.3%). Normal karyotype and/or chromosomal aberrations, which stratified patients to the intermediate cytogenetic risk group, were detected in 30 patients (47.6%). According to cytogenetics and molecular tests 13 patients (20.6%) were stratified into the high risk group. After the completion of induction chemotherapy, complete remission (CR) rate was achieved in 72.2% patients in the low risk, 53.2% in intermediate, and 15.3% in the high risk group. Median overall survival time was not achieved in the low risk group, and reached 449 and 135 days in the intermediate and high risk patients, respectively.
Conclusions. Complex genetic diagnostics with karyotyping and molecular tests allowed to allocate AML patients to different risk groups, which would not have been possible if only cytogenetic or molecular tests were used.
Wstęp
Ostre białaczki szpikowe (OBS) stanowią heterogenną grupę chorób różniących się morfologią komórek, przebiegiem klinicznym i rokowaniem. W 2001 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaproponowała nowy podział OBS, uwzględniający występowanie zaburzeń cytogenetycznych i odpowiadających im genów fuzyjnych (1). Rodzaj aberracji cytogenetycznych i molekularnych bardziej precyzyjnie określa biologię białaczek oraz stanowi niezależny czynnik prognostyczny, pozwalający zakwalifikować chorych do grup różniących się czasem przeżycia i rokowaniem. Pozwala to na wybór optymalnego sposobu leczenia w zależności od stopnia ryzyka. Poznanie mechanizmów genetycznych odpowiedzialnych za rozwój białaczek może pozwolić również na identyfikację potencjalnych celów dla nowej generacji leków przeciwnowotworowych.
Klonalne zaburzenia chromosomalne są wykrywane u 70% pacjentów z OBS w czasie rozpoznania (1). Dotychczas zostało opisanych około 200 strukturalnych i ilościowych zaburzeń, w tym translokacje wzajemne, insercje, delecje, izolowane trisomie lub monosomie, izochromosomy (2). Częstość występowania tych zaburzeń jest różna, a niektóre zostały opisane tylko w pojedynczych przypadkach OBS. Istnieje korelacja pomiędzy rodzajem występujących aberracji chromosomalnych, a wiekiem chorych, np. t(8;21), inv(16), t(15;17) częściej występują w młodszej grupie wiekowej (3, 4, 5, 6). Również częściej zaburzenia chromosomalne występują u dzieci z rozpoznaną de novo OBS niż u osób dorosłych, chociaż przyczyna tych różnic nie jest poznana (2). Niektóre zmiany strukturalne są związane z określonym podtypem białaczki według klasyfikacji WHO, np. translokacje t(8;21) z podtypem M2; t(15;17), t(11;17), t(5;17) z podtypem M3; inv/del16 z wariantem eozynofilowym OBS M4 (2, 6, 7). Inne aberracje, w tym +8, –7/7q- lub 5q występują w różnych typach białaczek, jak również w zespołach mielodysplastycznych oraz białaczkach wtórnych, bez uchwytnego związku z określonym typem morfologicznym OBS (8-10).
W ostatnim czasie na podstawie trzech dużych wieloośrodkowych badań zaproponowano stratyfikację chorych z de novo OBS do trzech grup ryzyka cytogenetycznego (tab. 1). Zostały one zdefiniowane w Europie przez grupę MRC (Medical Research Council), a w Stanach Zjednoczonych przez grupy SWOG (Southwestern Oncology Group), ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) i CALGB (Cancer and Leukemia Group B).
Tabela 1. Grupy ryzyka genetycznego w ostrych białaczkach szpikowych według Medical Research Council (MRC) i Southwestern Oncology Group (SWOG) i Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG).
| Grupa ryzyka | Kryteria grupy MRC | Kryteria grupy SWOG/ECOG |
| Niskiego | t(15;17) - z inną aberracją inv(16)/t(16;16) z inną aberracją t(8;21) - z jakąkolwiek inną aberracją chromosomalną | t (15;17) - z inną aberracją inv(16)/t(16;16)/del(16q) - z inną aberracją t(8;21) - bez del(9q) i złożonego kariotypu |
| Pośredniego | +8, -Y, +6, del(12p) normalny kariotyp, zmiany w 11q23, del(9q), del(7q) - bez innych zmian, złożone zmiany w kariotypie w liczbie 3-4, zmiany o nieokreślonym znaczeniu | +8, -Y, +6, del(12p) normalny kariotyp |
| Wysokiego | -5 lub del(5q), -7, lub t(8;21) z del(9q) lub złożonymi zmianami kariotypu, inv(3q), 20q, 21q, t(6;9), t(9;22), zmiany 17p, złożone zmiany kariotypu w liczbie co najmniej 5 | -5/del (5q), -7/del (7q) t (8;21) z del(9q) lub złożonym kariotypem inv(3q), zmiany 11q23, 20q 21q, del(9q), t(6;9) t(9;22), zmiany 17p złożony kariotyp (ł 3 zmian) |
Badanie kariotypu metodą prążkową jest podstawowym badaniem cytogenetycznym, które pozwala na ocenę liczby i budowy chromosomów. Cennym uzupełnieniem kariotypu jest badanie sondami hybrydyzacyjnymi, wyznakowanymi barwnikami (FISH) swoistymi dla poszczególnych chromosomów lub genów. Metoda fusion FISH pozwala na wykrycie genów fuzyjnych, split FISH na stwierdzenie monosomii lub delecji fragmentów chromosomów. Wykrywanie genów fuzyjnych znajduje zastosowanie do ustalenia typu OBS, rodzaju leczenia oraz monitorowania choroby resztkowej (MRD). Rozwój nowych, bardziej czułych technik molekularnych (gniazdowy PCR, RQ-PCR), umożliwił również bardziej precyzyjną ocenę skuteczności leczenia.
Metody cytogenetyki molekularnej (FISH) oraz biologii molekularnej (RT-PCR), pozwalają w niektórych przypadkach rozpoznać zaburzenia genetyczne z większą czułością w porównaniu do klasycznych metod cytogenetycznych. Tak jest w przypadku chorych z aberracjami dotyczącymi core binding factor [t(8;21 i inv(16)/t(16;16)], w których metody te są jedynym narzędziem pozwalającym na wykazanie istniejących zaburzeń genetycznych. U niewielkiego odsetka chorych z prawidłowym kariotypem, stratyfikowanych do grupy pośredniego ryzyka na podstawie klasycznych metod cytogenetycznych udaje się wykryć metodami molekularnymi (RT-PCR, FISH) obecność genów fuzyjnych charakterystycznych dla t(8;21) lub inv(16). Wykorzystanie metod biologii molekularnej równolegle z klasycznymi metodami cytogenetycznymi pozwala na wyodrębnienie tej grupy chorych i stratyfikację ich do odpowiedniej grupy ryzyka, co ma znaczenie dla wyboru leczenia i monitorowania jego skuteczności. Przedmiotem obecnych badań była kompleksowa diagnostyka genetyczna u chorych z OBS w oparciu o kariotyp i badania molekularne genów fuzyjnych, celem oceny przydatności tych metod w stratyfikacji chorych do określonych grup rokowniczych.
Materiały i metody
Pacjenci. W latach 2003-2006 do badań zakwalifikowano 63 chorych z OBS de novo, u których w momencie rozpoznania wykonano kompleksową diagnostykę genetyczną w oparciu o badania cytogenetyczne i molekularne. Średnia wieku badanych chorych wynosiła 50 lat (zakres, 21-79). Rozpoznanie OBS ustalono na podstawie kryteriów klasyfikacji WHO, w oparciu o badania cytologiczne, cytochemiczne i immunofenotypowe. Charakterystykę kliniczną chorych zakwalifikowanych do badań przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 2. Charakterystyka 63 chorych z ostrą białaczką szpikową (OBS) zakwalifikowanych do badań genetycznych.
| Liczba chorych | 63 |
| Wiek | 50 lat (zakres, 21-79 lat) |
| Płeć: K/M | 25/38 |
| Leukocytoza w chwili rozpoznania x 109/l | 37,1 (0,5-190) |
| Hepatomegalia | 17 (31%) |
| Splenomegalia | 23 (42%) |
| Limfadenopatia | 15 (27%) |
| Podtyp OBS: | |
| MO | 3 (5,5%) |
| M1 | 6 (11,1%) |
| M2 | 20 (29,6%) |
| M3 | 12 (22,2%) |
| M4 | 13 (24,3%) |
| M5 | 7 (5,5%) |
| M6 | 2 (1,8%) |
| Leczenie indukujące | |
| DA1 | 24 |
| DAC2 | 14 |
| DAF3 | 7 |
| AIDA4 | 10 |
| Protokół leczenia OBS dla osób starszych (AraC, 6-TG, Mtx)5 | 6 |
1Daunorubicyna 60 mg/m2 dn. 1-3, Arabinozyd cytozyny 200 mg/m2 c.i dn. 1-7; 2Daunorubicyna 60 mg/m2 dn. 1-3, Arabinozyd cytozyny 200 mg/m2 c.i dn. 1-7, Kladrybina 5 mg/m2 dn. 1-5; 3Daunorubicyna 60 mg/m2 dn. 1-3, Arabinozyd cytozyny 200 mg/m2 c.i dn. 1-7, Fludarabina 25 mg/m2 dn. 1-5; 4Idarubicyna 12 mg/m2 w dn. 2, 4, 6, 8 Atra 45 mg/m2/d do czasu uzyskania całkowitej remisji; 5Arabinozyd cytozyny 100 mg/m2 – 5 dni, 6-Tioguanina 60 mg/m2/d w I i III tygodniu, Metotreksat 15 mg/m2 1 x w tygodniu.
Większość chorych otrzymała leczenie indukujące remisję w ramach programu PALG-AML-1/2004, w tym 24 chorych (38%) DA-7 (Daunorubicyna 45-60 mg/m2 przez 3 dni, Arabinozyd cytozyny 200 mg/m2 przez 7 dni), 14 chorych (22,2%) DAC-7 (Daunorubicyna 45-60 mg/m2 przez 3 dni, Arabinozyd cytozyny 200 mg/m2 przez 7 dni, Kladrybina 5 mg/m2 przez 5 dni) i 7 chorych (11,1%) DAF-7 (Daunorubicyna 45-60 mg/m2 przez 3 dni, Arabinozyd cytozyny 200 mg/m2 przez 7 dni, Fludarabina 25 mg/m2 przez 5 dni). Chorzy z rozpoznaniem OBS M3 otrzymywali leczenie indukująco-konsolidujące zgodnie z protokołem PETHEMA-2005. Sześciu chorych z OBS w starszej grupie wiekowej leczonych było cyklami indukującymi o zmniejszonej intensywności, w tym arabinozydem cytozyny (AraC), 6-tioguaniną (6-TG) i metotreksatem (tab. 2).
Chorzy, którzy uzyskali całkowitą remisję (CR) po leczeniu indukującym, otrzymywali leczenie konsolidujące składające się z AraC i Mitoksantronu (HAM) i wysokich dawek AraC (HDAraC). Cykl indukujący powtarzano w przypadku uzyskania częściowej remisji (PR), a w przypadku utrzymywania się PR lub braku remisji (NR) po dwóch kursach leczenia indukującego, stosowano alternatywne leczenie reindukujące.
Postępowanie po zakończeniu leczenia konsolidującego i uzyskania CR uzależnione było od wyjściowego ryzyka genetycznego. Chorzy z grupy niskiego ryzyka, nie byli zwykle kwalifikowani do przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych i otrzymywali leczenie podtrzymujące przez okres dwóch lat. Chorzy z grupy pośredniego ryzyka genetycznego i mający zgodnego dawcę rodzinnego byli kwalifikowani do allogenicznego przeszczepienia macierzystych komórek krwiotwórczych (allo-HSCT) w pierwszej lub w drugiej CR. W grupie wysokiego ryzyka cytogenetycznego, decyzje o allo-HSCT od dawcy rodzinnego lub niespokrewnionego podejmowano już w trakcie trwania pierwszej remisji choroby.
Badania genetyczne. U wszystkich 63 chorych wykonano ocenę kariotypu metodą prążkową i badania molekularne (RT-PCR i nested PCR) na obecność genów fuzyjnych przed rozpoczęciem leczenia indukującego. W przypadku wszystkich podtypów OBS, z wyjątkiem OBS M3 (białaczka promielocytowa) według klasyfikacji WHO, badano obecność AML-ETO i CBFB-MYH11. U chorych z OBS M3 badano obecność genu fuzyjnego PML-RARA.
RNA izolowano metodą kolumienkową ( QIAamp RNA Blond Mini kit,Qiagen)z leukocytów szpiku i/lub krwi obwodowej, a następnie poddawano odwrotnej transkrypcji ( SuperScript First-Strand Synthesis System for RT - PCR, Invitrogen), z użyciem Super Script II i random heksamerów. Parametry i startery reakcji RT-PCR i nested PCR zostały ustalone zgodnie z protokołem BIOMED-1. Reakcje PCR przeprowadzane były z użyciem swoistych starterów (250 nM), dNTPs (200 μM), buforu (20 mM Tris-HCL, 50 mM KCl, pH 8,4), MgCl2 (1 mM), Taq DNA polimerazy Platinum (1U). Do metody nested PCR stosowano DNA z pierwszego PCR, zachowując takie same warunki reakcji PCR, ale z użyciem starterów wewnętrznych. Każdorazowo stosowane były kontrole dodatnie (cDNA z linii komórkowej K562) i kontrole ujemne, zawierające mieszaninę reakcyjną bez DNA. Analizy produktów PCR dokonywano w oparciu o elektroforezę na żelu agarozowym i oglądanie w świetle lampy UV.
Wyniki
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Harris N.L., et al.: World Health Organization Classification of Neoplastic Diseases of Hematopoietic and Lymphoid Tissues: Report of the Clinical Advisory Committee Meeting – Airlie House, Virginia, November 1997. J. Clin. Oncol., 1999; 17: 3835-3849.
2. Mrózek K., et al.: Cytogentics in acute leukemia. Blood Rev. 2004; 18: 115-136.
3. Mrózek K., et al.: Comparison of cytogenetic and molecular genetic detection of t(8;21) and inv(16) in a prospective series of adults with de novo acute myeloid leukemia: a cancer and leukemia group B study. J. Clin. Oncol. 2001; 19: 2482-2492.
4. Penaux P., et al.: Cytogenetics and their prognostic value in de novo acute myeloid leukaemia: a report on 283 cases. Br. J. Haematol. 1989; 73: 61-67.
5. Grimwade D., et al.: The predictive value of hierarchical cytogenetic classification in older adults with acute myeloid leukemia (AML): analysis of 1065 patients entered into the United Kingdom Medical Research Council AML 11 trial. Blood 2001; 98: 1312-1320.
6. Schoch C., et al.: Acute myeloid leukemia with recurring chromosome abnormalities, FAB subtypes and age distribution in an unselected series of 1897 patients with acute myeloid leukemia. Haematologica 2003; 88: 351-352.
7. Haferlach T., et al.: A new prognostic score for patients with acute myeloid leukemia based on cytogenetics and early blast clearance in trials of the German AML Cooperative Group. Haematologica 2004; 89: 498-418.
8. Wolman S.R., et al.: Impact of trisomy 8 (+8) on clinical presentation, treatment response, and survival in acute myeloid leukemia: a Southwest Oncology Group study. Blood 2002; 100: 29-35.
9. Hrusak O., Porwit-MacDonald A.: Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia 2002; 16:1233-1258.
10. Rossi G., et al.: Cytogenetic analogy between myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia of elderly patients. Leukaemia 2000; 14: 636-641.
11. Slovak M.L., et al.: Karyotypic analysis predicts outcome of preremission and postremission therapy in adult acute myeloid leukemia: a Southwest Oncology Group/Eastern Coopertive Oncology Group Study. Blood; 1999: 4075-4083.
12. Schoch C., et al.: Fifty-one patients with acute myeloid leukemia and translocation t(8;21)(q22;q22) an additional deletion in 9q is an adverse prognostic factor. Leukemia 1996; 10: 1288-1295.
13. Byrd J.C., et al.: Pretreatment cytogenetic abnormalities are predictive of induction success, cumulative incidence of relapse, and overall survival in adult patients with de novo acute myeloid leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B (CALBG 8461). Blood 2002; 100: 4325-4336.
14. Marcucci G., et al.: Abnormal cytogenetics at date of morphologic complete remission predicts short overall and disease-free survival, and higher relapse rate in adult acute myeloid leukemia: results from cancer and leukemia group B study 8461. J. Clin. Oncol. 2004; 22: 2410-2418.
15. Linker C.A.: Autologous stem cell transplantation for acute myloid leukemia. Bone Marrow Transplant. 2003; 31: 731-738.
16. Cornelissen J.J., Löwenberg B.: Role of Allogeneic Stem Cell Transplantation in Current Treatment of Acute Myeloid Leukemia. Haematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program). 2005; 151-155.
17. Schoch C., et al.: Patients with de novo acute myeloid leukaemia and complex karyotype aberrations show a poor prognosis despite intensive treatment: study of 90 patients. Br. J. Haematol. 2001; 112: 118-126.
18. Drobyski W.R.: The role of allogeneic transplantation in high-risk acute myelogenous leukemia. Leukemia 2004; 18: 1565-1568.
19. Visani G., et al.: The prognostic value of cytogenetics in reinforced by the kind of induction/consolidation therapy in influencing the outcome of acute myeloid leukemia – analysis of 848 patients. Leukemia 2001; 15: 903-909.
