Komórki linii megakarioblastycznej Meg-01 mogą być przydatne jako model do badania procesu megakariocytopoezy oraz do analizy biosyntezy białek unikalnych dla linii megakariocytarnych. Komórki linii Meg-01 zostały pozyskane ze szpiku kostnego pacjenta w przełomie blastycznym przewlekłej białaczki szpikowej (pbsz) Ph⁺ (chromosom Filadelfia). Na powierzchni megakarioblastów Meg-01 jest obecna glikoproteina GpIIb/IIIa (CD41a), charakterystyczna dla megakariocytów (Mk) i płytek (1). Wiadomo, że antygen CD41a jest wczesnym markerem progenitorów Mk (2). W syntezie komponenty cukrowej glikoproteiny GpIIb/IIIa uczestniczy α1,6-fukozylotransferaza (6FucT) (3). Obserwowana korelacja aktywności 6FucT z ekspresją antygenu CD41a⁺ w procesie megakariocytopoezy in vitro sugeruje, że aktywność tego enzymu może stanowić wskaźnik różnicowania i dojrzewania komórek CD34⁺ w kierunku Mk (4). W procesie megakariocytopoezy kluczową rolę w morfologii, proliferacji, ruchliwości oraz przeżyciu komórki pełnią białka z rodziny kinaz tyrozynowych Src (5). Potwierdzono obecność sześciu kinaz Src w Mk, przy czym dwie z nich: Fyn i Lyn, wyróżniały się wysokim poziomem ekspresji. Obie kinazy były aktywowane w Mk w obecności trombopoetyny (TPO), co wskazywało na istotną rolę Fyn i Lyn w procesie megakariocytopoezy (6). Wiadomo, że kinazy Src hamują różnicowanie Mk (7). Lannutti i wsp. wykazali efekt inhibitora kinaz Src, SU6656, na indukowane TPO dojrzewanie Mk (8). W obecności SU6656 obserwowano zahamowanie podziałów komórek linii megakariocytarnej UT-7/TPO, przy jednoczesnej kontynuacji akumulacji DNA w procesie endomitozy. Inhibitor stymulował także wzrost ekspresji antygenu CD41(GpIIb) oraz CD61(GpIIIa). Podobny efekt na poliploidyzację i różnicowanie Mk był obserwowany w czasie ekspansji pierwotnych Mk, w komórkach szpiku kostnego pacjentów z zespołami mielodysplastycznymi oraz innych liniach komórkowych K562 i HEL, posiadających potencjał Mk. A zatem SU6656 jest użyteczny, nie tylko, jako czynnik indukujący różnicowanie Mk, ale również może być stosowany w badaniach prowadzących do zrozumienia molekularnych podstaw endomitozy Mk (8).

Celem pracy była ocena wpływu SU6656 na komórki linii Meg-01. W wybranych dniach hodowli komórki poddawano analizie morfologicznej, fenotypowej, ploidii a także oznaczano aktywność 6FucT.

Meg-01 jest megakarioblastyczną linią komórkową (ATCC) wyprowadzoną, w 1983 roku przez M. Ogura i wsp. (1) w Nagoya University School of Medicine, Nagoya, Japan, ze szpiku kostnego pacjenta w kryzie blastycznej przewlekłej białaczki szpikowej Ph⁺. Komórki Meg-01 hodowano w gęstości 2,5 x 10⁵ komórek/ml, w podłożu RPMI 1640 zawierającym glutamax (Gibco), 10% FBS (Gibco) i antybiotyk (SIGMA). Hodowle prowadzono w butelkach hodowlanych 25 cm² w inkubatorze CO₂ w 37°C, 5%CO₂ i 95% wilgotności. W wybranych dniach hodowli oceniano żywotność, gęstość, fenotyp, morfologię i ploidię komórek oraz oznaczano aktywność enzymu 6FucT. SU6656 (CalBiochem), inhibitor kinaz Src, rozpuszczano w DMSO i dodawano do podłoża w końcowym stężeniu 1 μM oraz 2,5 μM w 0,1% DMSO.

Oceny fenotypowej komórek dokonywano metodą FACS (w cytometrze FACSCalibur, BD Biosciences) z użyciem przeciwciał anty: CD3-FITC, CD14-PE, CD15-PE, CD19-PE, CD36-FITC, CD41a-FITC, CD42b-PE, CD71-PE, GPA-PE (glikoforyna A-PE) z zastosowaniem odpowiednich kontroli izotypowych (BD Pharmingen).

Ploidię komórek oceniano pomiarem zawartości DNA metodą FACS (w cytometrze przepływowym Becton Dicinson; Vantage) z użyciem przeciwciał anty-CD41a-FITC (BD Pharmingen) oraz DAPI (Molecular Probe), stosując odpowiednią kontrolę izotypową (BD Pharmingen).

Aktywność enzymu 6FucT oznaczano w komórkach, poddanych solubilizacji, metodą izotopową. Preparat enzymu inkubowano z substratami GDP [14C] fukozą (Amersham) i asialoagalaktotransferyną glikopeptydem, a następnie produkt reakcji izolowano metodą chromatograficzną i analizowano przy użyciu licznika scyntylacyjnego (9).

Morfologię komórek Meg-01 analizowano w mikroskopie świetlnym po uprzednim barwieniu komórek metodą May-Grünwalda Giemsy.

Komórki linii Meg-01, wczesne formy megakarioblastów, hodowano w podłożu RPMI z 10% FBS w obecności 1,0 μM i 2,5 μM selektywnego inhibitora kinaz Src, SU6656. W wybranych dniach hodowli analizowano żywotność, gęstość, morfologię, fenotyp, ploidię komórek oraz oznaczano aktywność enzymu 6FucT. Inhibitor, w sposób zależny od stężenia, hamował proliferację komórek Meg-01 w hodowli (ryc. 1).

Ocena morfologiczna komórek uwidoczniła różnicowanie i dojrzewanie komórek Meg-01 w obecności SU6656 (ryc. 2). W preparatach obserwowano duże komórki, których średnica osiągała nawet 60 μm (12 μm – 60 μm), z wielopłatowym jądrem wskazującym na indukcję podziałów endomitotycznych. Średnica komórek w hodowli kontrolnej z DMSO wynosiła od 12 μm do 20 μm. Komórki pod wpływem inhibitora zwiększały swoją średnicę nawet pięciokrotnie. W cytoplazmie obserwowano pojawianie się licznych ziarnistości.

W trakcie hodowli Meg-01 badano ekspresję antygenów powierzchniowych linii megakariocytarnej (CD41a, CD42b) oraz antygenów innych linii hematopoetycznych: linii erytroidalnej (GPA, CD36), limfoidalnej (CD3, CD19), mieloidalnej (CD14, CD15) (tab. 1). W obecności inhibitora kinaz Src obserwowano zmiany w fenotypie komórek Meg-01. Wyraźny wzrost odsetka komórek CD41a⁺ przy jednoczesnym spadku odsetka komórek GPA⁺, CD36⁺ oraz brak obecności antygenów limfoidalnych CD3 i CD19 oraz mieloidalnych CD14 i CD15 na powierzchni komórek świadczył o różnicowaniu komórek w kierunku Mk. Antygen CD42b (GpIb), marker dojrzalszych form Mk, nie był obecny na powierzchni komórek Meg-01 w hodowli z SU6656. Wcześniejsza charakterystyka Meg-01 potwierdziła, że glikoproteina GpIb jest obecna tylko w cytoplazmie większych komórek Meg-01 oraz, że komórki te nie posiadają markerów zarówno limfocytów B i T, jak i komórek mieloidalnych (1). Obecność antygenu CD71, receptora dla transferyny, jest charakterystyczna dla dzielących się komórek. W związku z tym obserwowany spadek odsetka komórek CD71⁺ świadczy o hamowaniu proliferacji komórek Meg-01 przez SU6656 (tab. 1). Mk są unikalnymi komórkami hematopoetycznymi ze względu na poliploidalność jądra komórkowego, które powstaje w wyniku procesu endomitozy. Wcześniejsze badanie kariotypu komórek Meg-01 ujawniło, że posiadają one hyperdiploidalny kariotyp ze średnią liczbą chromosomów 56-58 (od 50 do 113) (1). Analiza ploidii komórek Meg-01 hodowanych w obecności SU6656 potwierdziła wpływ inhibitora na stymulację procesu endomitozy (ryc. 3). Obserwowany na histogramach wzrost odsetka komórek Meg-01 o fenotypie CD41a⁺ charakteryzujących się podwyższoną ploidią zależał od stężenia SU6656 w hodowli.