Wykrywanie choroby resztkowej (MRD), z klinicznego punktu widzenia, jest jednym z najważniejszych wskaźników prognostycznych w ocenie przebiegu leczenia i ryzyka nawrotu choroby w ostrych białaczkach. Monitorowanie choroby resztkowej u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (OBL), zwłaszcza w początkowym etapie terapii indukującym remisję, jest szczególnie użyteczne w ocenie odpowiedzi na leczenie. Utrzymywanie się populacji komórek białaczkowych w szpiku, może decydować o ewentualnym zmodyfikowaniu terapii, a regularne kontrole szpiku pacjentów, pozwalają na wcześniejsze wykrycie wznowy choroby (1, 2). Udowodniono również istotne znaczenie nasilenia choroby resztkowej, zarówno u pacjentów przygotowywanych do, jak i po allogenicznym przeszczepie szpiku, jako istotnego czynnika wpływającego na wynik transplantacji (3, 4). Obecnie najbardziej swoistymi i najczulszymi metodami w ocenie MRD są techniki molekularne – ilościowa analiza real-time PCR (RQ-PCR) transkryptów genów fuzyjnych i rearanżacji genów immunoglobulin i/lub receptorów komórek T, oraz wykrywanie specyficznego immunofenotypu komórek rozrostowych metodą wieloparametrowej cytometrii przepływowej. Użyteczność tych technik, zwłaszcza w odniesieniu do badania choroby resztkowej u dzieci z OBL, była wielokrotnie opisywana w literaturze (5-7).

Cytometria przepływowa w związku z intensywnym rozwojem w ostatnich latach, stała się doskonałym narzędziem w diagnostyce i monitorowaniu przebiegu terapii w schorzeniach układu krwiotwórczego. Technika ta umożliwia opis populacji komórek na podstawie ich wielkości, ziarnistości, odsetka komórek wykazujących ekspresję powierzchniowych lub cytoplazmatycznych determinant oraz określenie poziomu ich ekspresji, na podstawie intensywności fluorescencji (8). Metodą cytometrii przepływowej można wykryć resztkowe komórki blastyczne u pacjentów, którzy pod względem morfologicznych kryteriów (<5% blastów w szpiku), wydają się być w remisji całkowitej. Na podstawie immunofenotypu ustalonego podczas rozpoznania metodą tą można rozróżnić 1 komórkę blastyczną wśród 10³-10⁴ komórkach jądrzastych szpiku (9).

Ostre białaczki limfoblastyczne B charakteryzują się występowaniem w szpiku i krwi chorego komórek z linii B, których rozwój zatrzymany został na wczesnym etapie dojrzewania. Jest to ekspansja klonu komórek i nagromadzenie się prekursorów limfocytów, które utraciły zdolność dalszego różnicowania, o fenotypie charakterystycznym dla komórek młodych, z możliwością ekspresji antygenów z innych linii różnicowania. Jednak w części przypadków OBL, zwłaszcza z prekursorowych komórek B, komórki blastyczne nie wykazują ekspresji dodatkowych antygenów nieliniowych takich jak np. markery mieloidalne, a ich immunofenotyp, pod względem jakościowym, często jest bardzo zbliżony do prawidłowych hematopoetycznych komórek progenitorowych. Limfoblasty białaczkowe, pod względem immunofenotypowym, zwłaszcza w ekspresji CD34, CD10 i TdT, przypominają prawidłowe prekursory komórek B (10, 11). Stanowi to poważną przeszkodę w oszacowaniu MRD po chemioterapii, czy we wczesnej fazie regeneracji szpiku po przeszczepie, kiedy to następuje często ekspansja prawidłowych prekursorów (odnowa szpiku). Co więcej, jak donoszą van Lochem i wsp. (12), odsetek poszczególnych subpopulacji prekursorowych komórek B, w zależności od zastosowanej terapii, może być różny. W takich przypadkach, przy użyciu standardowych metod analizy, poszukiwanie choroby resztkowej i monitorowanie leczenia jest utrudnione i niewiarygodne.

W detekcji MRD metodą immunofenotypowania, stosuje się dwie strategie: poszukiwanie na blastach białaczkowych markerów właściwych dla innych linii komórkowych – różnicowanie jakościowe (13) oraz wykorzystanie ilościowej różnicy w intensywności ekspresji antygenów liniowych, w tym poszukiwanie komórek o fenotypach asynchronicznych (równoczesne występowanie na blastach białaczkowych antygenów o sile ekspresji właściwej dla różnych stadiów dojrzewania komórki). Ilościowe różnice w ekspresji antygenów na komórkach nowotworowych w detekcji MRD, wykorzystuje cytometryczna metoda tzw. „pustych pól” (empty spaces – ES). Charakterystyczne aberrantne immunofenotypy limfoblastów, wykrywa się w niej za pomocą znakowania odpowiednimi, trój- lub czterokolorowymi, zestawami przeciwciał monoklonalnych. Podstawą wprowadzenia metody „pustych pól”, była identyfikacja immunofenotypu wszystkich subpopulacji limfoblastów B, występujących w szpiku zdrowych dawców. Poprzez barwienie trójkolorowymi zestawami przeciwciał, można wyodrębnić trzy główne populacje prawidłowych limfoblastów, różniących się ekspresją poszczególnych antygenów (14). Fenotyp aberrantny jest definiowany poprzez bezpośrednie porównanie intensywności ekspresji poszczególnych antygenów na komórkach pacjenta, z komórkami prawidłowymi. Na wykresie cytometrycznym typu dot plot, otrzymujemy obraz populacji blastów, o zmienionej intensywności świecenia. Lokuje się ona wówczas w tzw. „pustym polu”, czyli poza bramką referencyjną, w miejscu, w którym w prawidłowym szpiku komórki nie występują (14, 15). Taka porównawcza analiza, pozwala w momencie rozpoznania na stworzenie dla każdego pacjenta odpowiedniego protokołu, który następnie służy do monitorowania choroby resztkowej.

Materiał do badań stanowiły aspiraty szpiku kostnego 20 dorosłych pacjentów (11 kobiet i 9 mężczyzn), w przedziale wiekowym 18-67 lat (średni 41 lat) z ostrą białaczką limfoblastyczną z linii B. Badania wykonywano podczas rozpoznania choroby (u 20 chorych) oraz w kolejnych etapach leczenia: indukcji, konsolidacji i kontroli po przeszczepie szpiku (u 17 chorych). Do zdefiniowania subpopulacji limfocytów występujących w prawidłowym szpiku, posłużyły próbki szpiku 5 zdrowych dawców. Immunofenotypowanie komórek przeprowadzano metodą trójkolorowej cytometrii przepływowej (Aparat Canto – Becton Dickinson) z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromami: FITC, PE oraz PE-Cy5. Poddawano je standardowej procedurze bezpośredniego barwienia opisanej wcześniej m.in. przez Lucio i wsp. (16). Stosowano następujące zestawy przeciwciał: CD10/CD20/CD19, CD34/CD22/CD19, CD34/CD38/CD19, CD45/CD34/CD19, TdT/CD10/CD19. W poszukiwaniu fenotypów aberrantnych posługiwano się również przeciwciałami przeciwko antygenom mieloidalnym: CD13, CD15, CD33, CD65, CD66. Sprawdzano także znaczenie obecności nadekspresji antygenu CD58 na limfoblastach B, jako czynnika różnicującego je z prawidłowymi komórkami szpiku.

Akwizycję i analizę uzyskanych danych przeprowadzono przy pomocy programu FacsDiva. Każdorazowo analizowano co najmniej 10 000 komórek, przy określaniu nasilenia choroby resztkowej – 50 000 komórek. Ekspresję zastosowanych antygenów analizowano z bramki ustawionej na komórkach CD19+. Otrzymane dane o gęstości poszczególnych antygenów oraz o profilach antygenowych prawidłowych komórek CD19+, uwidocznione zostały na cytometrycznych wykresach typu dot plot. Miejsca, zajmowane przez występujące w prawidłowym szpiku komórki, wykorzystano jako bramki referencyjne. Populacje blastów pacjentów były charakteryzowane w każdym z zastosowanych zestawów przeciwciał, poprzez porównanie ich poziomu fluorescencji z obrazem otrzymanym dla komórek prawidłowych. Do monitorowania choroby resztkowej wybierano fenotypy aberrantne, występujące podczas rozpoznania, na ponad 50% komórek blastycznych CD19+. MRD przyjmowano za dodatnie, gdy w badanym materiale wykryte zostały komórki nieprawidłowe na poziomie ponad 0,1% komórek jądrzastych szpiku.

Zastosowanie metody „pustych pól” w charakterystyce populacji komórek rozrostowych podczas rozpoznania choroby, pozwoliło na identyfikację aberrantnych fenotypów u 18 pacjentów z OBL-B (90%), z czego przynajmniej dwa fenotypy aberrantne wykryto u 15 pacjentów (75%).

U dwóch chorych komórki blastyczne były najbardziej zbliżone immunofenotypowo do komórek prawidłowych. Nie lokowały się one poza referencyjnymi bramkami, stąd do poszukiwania choroby resztkowej wykorzystywano głównie, wykrytą podczas diagnozy, obecność antygenów mieloidalnych. Częstości wykrywania nietypowych fenotypów blastów, w momencie rozpoznania choroby, w poszczególnych złożeniach przeciwciał, przedstawia tabela 1.

Zestawem przeciwciał, z użyciem którego najczęściej wykrywano fenotypy aberrantne było złożenie TdT/CD10/CD19. Pozwoliło ono na wykrycie charakterystycznych białaczkowych fenotypów u 11 z 18 przebadanych chorych (61%). Lokowanie się blastów w „pustym polu”, związane było przede wszystkim ze słabą ekspresją cytoplazmatycznego TdT, w połączeniu z brakiem ekspresji (6 przypadków) (ryc. 1.V.B) lub nadekspresją molekuły powierzchniowej CD10 (3 przypadki). U dwóch chorych stwierdzono nadekspresję TdT na komórkach CD19+CD10+. Przy zastosowaniu zestawu CD10/CD20/CD19 wyodrębniono nietypowe populacje blastów u 12 chorych. Komórki CD19+ wykazywały 3 profile antygenowe: CD10-CD20- (6 pacjentów), nadekspresja molekuły powierzchniowej CD10 bez obecności antygenu CD20 (2 pacjentów) i z heterogenną ekspresją CD20 (4 pacjentów) (ryc. 1.I.B). Stosując zestaw antygenów CD45/CD34/CD19, na wykresie cytometrycznym, obserwowano lokowanie się blastów w miejscach, wskazujących na słabą lub ujemną ekspresję antygenu panleukocytarnego CD45, w porównaniu z limfoblastami B występującymi fizjologicznie w prawidłowym szpiku. Były to trzy przypadki z typową ekspresją CD34 (ryc. 1.IV.B) oraz jeden z brakiem CD34. Inną cechą charakteryzowanych blastów było mocniejsze wiązanie przeciwciał anty-CD34 przy typowej ekspresji CD45 (4 przypadki). Potrójne barwienie CD34/CD38/CD19 pozwoliło na wyodrębnienie 2 profili antygenowych populacji blastów: o słabej, heterogennej ekspresji molekuły CD38 na komórkach CD19+CD34+ (5 przypadków) (ryc. 1.III.B) oraz populacji komórek o asynchronicznym fenotypie CD19+CD34++CD38- (2 przypadki). U pięciu pacjentów blasty odróżniały się swoim fenotypem przy znakowaniu komórek zestawem przeciwciał CD34/CD22/CD19. Były to komórki CD19+CD22+ z mocniejszą ekspresją CD34 (3 przypadki) (ryc. 1.II.B) oraz takie, które przy normalnej ekspresji CD34, słabiej wiązały przeciwciało anty-CD22 (2 przypadki).