Hormon uwalniający hormon wzrostu (GHRH; growth hormone-releasing hormone), znany również pod nazwą somatoliberyna, jest neuropeptydem podwzgórzowym, który odpowiada za sekrecję GH (hormon wzrostu) przez przedni płat przysadki (1). GHRH po raz pierwszy został wyizolowany w 1980 roku z guza trzustki u pacjenta z akromegalią, a dopiero w następnej kolejności z tkanki podwzgórza (2-5). Opisano dwie jego izoformy, o podobnej aktywności biologicznej, składające się z 40 i 44 aminokwasów (6). Aktywnym biologicznie jest N-końcowy fragment peptydu, składający się z 29 aminokwasów (1). GHRH powstaje z 107 lub108-aminokwasowego prekursora w wyniku degradacji postranslacyjnej (7-9). Wykazuje podobną strukturę chemiczną do m.in. VIP, sekretyny, PACAP, GIP, glukagonu (10). Gen dla somatoliberyny został zlokalizowany w obrębie 20 chromosomu i składa się z pięciu eksonów (8). Struktura chemiczna hormonu zbudowanego z 44 aminokwasów jest następująca (5):

Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2.

Poza podwzgórzem i przysadką somatoliberynę udało się zlokalizować w wielu ludzkich tkankach, m.in. w łożysku, jajniku, jądrze, trzustce, a także w komórkach nerki, prostaty, wątroby, płuc, sutka, grasicy i komórkach układu immunologicznego (11-15). Ekspresję mRNA dla GHRH stwierdzono w komórkach nowotworowych, np. trzustki, płuc, jelit, rakowiaka, żołądka, mózgu, prostaty, jajnika, sutka, trzonu macicy, węzłów chłonnych (12, 16-19). Znane jest także zjawisko ekotopowego wydzielania GHRH przez neuroendokrynne guzy przewodu pokarmowego (rakowiak, guzy trzustki), raka drobnokomórkowego płuc, guzy nadnercza i przysadki, pheochromocytoma (20).

Synteza GHRH ma miejsce w neuronach podwzgórzowych, zlokalizowanych w jądrze łukowatym i brzuszno-bocznym. Z ich aksonów, sięgających wyniosłości przyśrodkowej do przestrzeni okołonaczyniowej uwalniana jest somatoliberyna. Następnie siecią naczyń wrotnych dostaje się do części gruczołowej przysadki (21). Tutaj, łącząc się z receptorem (GHRH-R) na komórkach somatotropowych, pobudza syntezę i wydzielanie hormonu wzrostu (1).

Somatoliberyna, poza stymulacją wydzielania GH, jest odpowiedzialna za prawidłowy wzrost i różnicowanie się komórek somatotropowych przysadki (22). Wykazano, że jej niedobór, np. w wyniku mutacji receptora, prowadzi do hipoplazji przysadki i zmniejszenia sekrecji hormonu wzrostu (23). Poza tym GHRH wpływa na procesy snu i czuwania (24). Interleukina 1, która zwiększa ekspresję mRNA dla GHRH i GHRH-R w podwzgórzu, jest silnym stymulatorem snu (25, 26). Hormon ten może także oddziaływać modulująco na układ immunologiczny człowieka (13-15). Somatoliberynę i jej receptor zlokalizowano bowiem na niektórych komórkach układu odpornościowego, a także na splenocytach i tymocytach. Jednakże dokładna rola GHRH w regulacji procesów odpornościowych nie została poznana.

Ponadto GHRH uważany jest za jeden z kluczowych czynników biorących udział w onkogenezie. Na wielu typach komórek nowotworowych wykryto obecność receptora dla GHRH (12, 16), wykazano ekspresję mRNA dla tego neurohormonu w tkankach nowotworowych (12, 16-19). Udowodniono, że neuropeptyd ten w warunkach in vitro pobudza proliferację komórek raka płuc, jajnika, trzustki, jelita grubego, żołądka, glejaka wielopostaciowego (16, 27-29). Należy dodać, że zaobserwowano zwiększoną częstość zachorowań na raka jelita grubego u osób z akromegalią (30). GHRH reguluje także sekrecję innych potencjalnych czynników kancerogenezy: hormonu wzrostu i insulinopodobnych czynników wzrostowych.

GH wpływa na proliferację guza sutka (31). Wykazano, że po usunięciu przysadki u myszy z osteosarcoma i fibrosarcoma masa przerzutów do płuc uległa zmniejszeniu (32, 33). Natomiast IGF-I, łącząc się z receptorem IGF-IR, wpływa stymulująco na procesy proliferacji i różnicowania tkanek organizmu, bierze udział w procesie angiogenezy i ma działanie antyapoptyczne. Receptor dla IGF-I zlokalizowano na wielu typach komórek nowotworowych, a także zaobserwowano ektopowe wydzielanie tego czynnika przez różne guzy. IGF-II (insulinopodobny czynnik wzrostowy typu drugiego), którego synteza jest niezależna od GHRH, jest również syntetyzowany przez tkanki nowotworowe. Działanie fizjologiczne tego czynnika odbywa się poprzez aktywację receptorów dla IGF-I (34).

Regulacja wydzielania somatoliberyny zależna jest od osi GHRH/GH/IGF-I. Na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego zarówno GH, jak i IGF-I hamują produkcję i wydzielanie GHRH. Sekrecja somatoliberyny jest także zależna od wpływu mediatorów ośrodkowego układu nerwowego. Acetylocholina, dopamina i noradrenalina (przez receptory beta) ją nasila, a GABA (kwas gamma-aminomasłowy) i noradrenalina (przez receptory alfa) hamuje (35). Natomiast glikokortykosteroidy pobudzają ekspresję receptora dla GHRH (36). Należy wspomnieć także o somatostatynie, która szczególnie poprzez receptor SSTR2 hamuje wydzielanie hormonu wzrostu przez komórki somatotropowe przysadki i pośrednio wpływa na stężenie GHRH (37). Poza tym wzrost sekrecji GH powoduje hipoglikemia poinsulinowa, a jej zmniejszenie następuje pod wpływem glikokortykosteridów i IGF-I (35). Innym czynnikiem regulującym wydzielanie powyższych hormonów jest ghrelina, peptyd produkowany głównie przez komórki żołądka i dwunastnicy. Ghrelina hamuje wydzielanie somatostatyny, a także jest odpowiedzialna za wzrost stężenia w surowicy krwi GH (38).

GHRH-R należy do II klasy receptorów sprzężonych z białkami G, w skład której wchodzą także receptory dla VIP (wazoaktywny peptyd jelitowy), sekretyny, PACAP (przysadkowy polipeptyd aktywujący cyklazę adenylową), glukagonu, GLP-1 (glukagenopodobny peptyd-1), GLP-2 (glukagenopodobny peptyd-2), glukozozależnego peptydu insulinotropowego, GIP (żołądkowy peptyd hamujący) i PHM (peptyd histydynowo-metioninnowy) (10). Receptory dla powyższych peptydów wykazują znaczną homologię budowy, np. sekwencja aminokwasów receptora dla VIP i GHRH jest zgodna w 47%. Gen dla GHRH-R zlokalizowano w obrębie chromosomu 7p14-15 i składa się z 13 eksonów. Ekspresję receptora regulują liczne czynniki transkrypcyjne, m.in. Pit-1, NF-1, Brn-2, Oct-1, AP-1, CRE (czynnik zależny od cAMP). Ponadto glikokortykosteroidy i przypuszczalnie hormony tarczycy zwiększają ekspresję tego receptora, a estrogeny (estradiol) ją zmniejszają (39). Receptor dla somatoliberyny zbudowany jest z siedmiu śródbłonowych domen, zewnątrzkomórkowego, hydrofilnego odcinka wiążącego ligand i długiej domeny cytoplazmatycznej. Na powierzchni błony komórkowej powiązany jest z kompleksem białka G – białka regulatorowego składającego się z trzech podjednostek: alfa, beta i gamma (40). Przyłączenie ligandu do receptora skutkuje wymianą GDP (związanego z podjednostką alfa) na GTP, a następnie oderwaniem się kompleksu GTP-alfa od pozostałych podjednostek. Powstałe w ten sposób dwa kompleksy: GTP-alfa i beta-gamma oddziaływają na efektory, takie jak cyklaza adenylanowa oraz fosfolipaza C. Cyklaza adenylanowa katalizuje przekształcenie ATP w cAMP, który aktywuje kinazę białkową A (PKA), która z kolei jest odpowiedzialna za fosforylację i zmianę konfiguracji białek kanału wapniowego. Konsekwencją tego procesu jest napływ jonów wapnia do wnętrza komórki. Wzrost stężenia wewnątrzkomórkowych jonów wapnia prowadzi do pobudzenia sekrecji hormonu wzrostu z komórek somatotropowych przysadki. Inna droga (cAMP-niezależna) wiąże się z pobudzeniem przez kompleks białka G aktywności fosfolipazy C, co powoduje wzrost stężenia trójfosforanu inozytolu (IP3) i w konsekwencji zwiększenie koncentracji jonów wapnia w komórce (22, 41-43) (Ryc. 1).

GHRH pobudza proliferację komórek najprawdopodobniej na drodze aktywacji szlaku białek Ras, Raf i MAPK, poprzez ich fosforylację. Kompleks kinaz białkowych MAPK ma udowodnione działanie mitogenne (45).

GHRH-R zlokalizowany jest głównie na komórkach somatotropowych przysadki i charakteryzuje się dużą swoistością wiązania z somatoliberyną, ale wykazano jego występowanie na komórkach innych tkanek, m.in. wątroby, płuca, nerki, prostaty, łożyska, sutka i jajnika (11, 12). Poza tym zaobserwowane w wielu pracach badawczych, hamujące działanie antagonistów GHRH na proliferację nowotworowych linii komórkowych in vitro, sugerujące miejscowy wpływ hamujący antagonistów na autokrynną produkcję GHRH (46), skłoniło do poszukiwań receptorów zlokalizowanych na komórkach nowotworowych. Kolejne projekty badawcze nie potwierdzały jednak powyższych założeń (47). Biorąc pod uwagę homologię budowy receptorów dla VIP (VPAC-R) i GHRH, fakt, że GHRH łączy się z VPAC-R, a także że receptory dla VIP i GHRH są zlokalizowane w błonie komórkowej różnych typów komórek nowotworowych, sugerowano wpływ GHRH na proliferację guzów poprzez oddziaływanie z VPAC-R (10, 48, 49). Hipoteza ta nie znalazła jednak potwierdzenia w dalszych projektach badawczych (50).

Według najnowszych doniesień w laboratorium prof. Schally´ego wyizolowano mRNA dla GHRH-R i jego czterech tzw. „splice” wariantów (SV1-4) z nowotworowych ludzkich linii komórkowych trzustki, prostaty, piersi, jajnika, płuca, mózgu, kości, jelita grubego, żołądka i węzłów chłonnych, kości, a także z komórek prawidłowych tkanek przysadki, płuc, prostaty, wątroby i nerki (12, 16, 18, 19, 51, 52). We wcześniejszych pracach opisano możliwość występowania splice wariantów receptora dla somatoliberyny na komórkach gruczolaka przysadki (53). Wszystkie badane nowotwory i zdrowe tkanki charakteryzowały się ekspresją mRNA dla przysadkowego GHRH-R i prawie wszystkie dla somatoliberyny (dla raka żołądka, jelita grubego analizy nie przeprowadzono). Z opisanych czterech wariantów receptorów GHRH-R podtyp SV1 wykazuje najwyższą strukturalną homologię do receptora przysadkowego i prawdopodobnie ma największy wpływ na procesy transformacji nowotworowej komórki. Jego obecność stwierdzono na błonie komórkowej wszystkich badanych tkanek, z wyjątkiem linii komórkowej raka płuc (tutaj występował tylko wariant SV4) (12).

Badając sekwencję nukleotydów cDNA kodującego SV1, wykazano brak trzech pierwszych eksonów na 5´ końcu nici DNA, z zachowaniem intronu trzeciego, który zawiera starter (kodon startu). Pozostała część nici DNA dla GHRH-R i SV1 jest identyczna, a różnica dotyczy 334 pierwszych nukleotydów. Brak trzech pierwszych eksonów skutkuje najprawdopodobniej utratą N-końcowej, pozakomórkowej domeny receptora, którą zstąpił 25 aminokwasowy fragment, spełniający jednak funkcję sygnałową. Natomiast nić cDNA kodująca wariant SV2, oprócz trzech pierwszych eksonów, nie zawiera także eksonu 7, dlatego białko receptora skrócone jest już po drugiej błonowej przez domenie. Receptor SV4 zbudowany jest tylko z pozakomórkowej domeny łączącej się z ligandem, gdyż w jego DNA brak jest także eksonu 5 i 6. Z kolei sekwencja nukleotydów dla SV3 jest zupełnie inna w porównaniu z pGHRH-R i SV1. Może to oznaczać odmienną strukturę białka i niewielkie znaczenie w procesach neoplastycznych (52, 54).

Wydaje się, że obecny na wielu typach nowotworów przysadkowy receptor dla somatoliberyny i jego cztery warianty, pełnią istotną rolę w patogenezie nowotworów.

Pierwszy antagonista GHRH ([N-Ac, Tyr, D- Arg]h GHRH(1-29)] został zsyntetyzowany przez Roggerecht´a i współpracowników w 1985 roku (55). Punktem wyjścia do otrzymania antagonisty GHRH była krótka forma somatoliberyny hGHRH(1-29), o pełnej aktywności biologicznej, składająca się z 29 aminokwasów. Zespół badaczy wykazał, że zamiana w drugiej pozycji alaniny na D-argininę powoduje, że tak zsyntetyzowany peptyd blokuje aktywność cyklazy adenylanowej w szczurzych komórkach przysadki, konsekwencją czego jest spadek wydzielania GH przez przysadkę szczura (55, 56). Obiecujące właściwości pierwszego antagonisty skłoniły do poszukiwania dalszych zastosowań, m.in. w endokrynologii i onkologii oraz syntezy pochodnych o większej aktywności biologicznej. Wzrost stabilności heliakalnej struktury białek otrzymano poprzez zamianę niektórych aminokwasów standardowego antagonisty na parachlorofenyloalaninę [Phe(4-Cl)], kwas aminobutyrowy (Abu) i norleucynę (Nle). Natomiast lepsza lipofilność, a tym samym łatwiejszą zdolność wiązania się z receptorem dla GHRH i przepuszczalność przez błony komórkowe były wynikiem acetylacji N-końca izobutylem czy fenacetylem. Zamiana w pozycji 29 argininy (Arg) na agmetynę (Agm) skutkowało powstaniem grupy związków, z których preparaty oznakowane symbolem MZ-4-71 i MZ-5-156 wykazały się najlepszą skutecznością. MZ-5-156 blokował wydzielanie GH z szczurzej przysadki in vitro 63-200 x silniej niż standardowy antagonista, natomiast in vivo spadek wydzielania był 20x większy (46, 57, 58). Podobnie antagonistyczne analogi JV-1-36 (w jego strukturze na pozycji 9 znajduje się arginina (Arg)), JV-1-38 (z sekwencją D-Arg-Har-NH2), JV-1-65 (z cytruliną w 9 pozycji), czy MZ-J-7-72 (z amidynofenalaniną z 9 pozycji) charakteryzują się silniejszym i dłuższym działaniem na oś przysadki szczura niż standardowy antagonista (59, 60).

Kolejnym etapem syntezy skuteczniejszych związków o działaniu antagonistycznym do GHRH była acetylacja N-końców JV-1-36, JV-1-38 i JV-1-65 jednokarboksylowymi lub dwukarboksylowymi kwasami, np. octanowym, dekanowym, laurynowym, palmitynowym, co znacznie zwiększyło lipofilność tych peptydów. Nowa grupa związków (głównie MZ-J-7-46, MZ-J-7-30) silnie blokowała wydzielanie GH z przysadki szczura, wykazywała się znacznie większą zdolnością wiązania z GHRH-R in vitro (MZ-J-7-46 prawie całkowicie blokował GHRH-R przez pierwsze 90 min) w porównaniu z JV-1-36, ale efekt hamowania GH in vivo był słabszy, chociaż bardziej długotrwały. Wykazano także, że antagonistyczne analogi GHRH hamowały proliferację komórek MiaPaCa (ludzka nowotworowa linia komórkowa trzustki) in vitro i komórek P-C3 (ludzka nowotworowa linia komórkowa prostaty hodowana na myszach) in vivo w znacząco większym stopniu, niż poprzedni antagoniści. Powyższe badania potwierdziły, że nowe lipopeptydy charakteryzują się lepszą aktywnością biologiczną w porównaniu z poprzednimi antagonistami i w przyszłości mogą być użyteczne jako potencjalne leki przeciwnowotworowe (61) (Tab. 1).

Somatoliberyna i jej syntetyczne analogi, jako najważniejsze czynniki pobudzające sekrecję hormonu wzrostu przez przysadkę, znalazły zastosowanie w diagnostyce chorób układu podwzgórzowo-przysadkowego i w leczeniu niskorosłości u dzieci.