Odpowiedź na to pytanie nie jest prosta. Oceny porównywania stopnia doboru w zakresie HLA i efektów przeszczepiania są bowiem trudne. Muszą opierać się na dużej liczbie przypadków, które nie powinny się różnić między sobą pod względem rozpoznania, okresu choroby, wieku itp. Ponadto w poszczególnych okresach stopień doboru był (i nadal będzie) uwarunkowany praktycznymi możliwościami stosowania różnych metod oznaczania HLA (metody serologiczne – wykrywające antygeny HLA lub/i molekularne, o różnym stopniu rozdzielczości, wykrywające allele genów HLA). Wobec tego nie można sumować poszczególnych grup chorych, nawet względnie jednorodnych. Stąd liczebność grup, nawet analizowanych w programach międzynarodowych, jest mała (3, 16, 19). Dotyczy to szczególnie przeszczepów od dawców niespokrewnionych. Analiza zależności pomiędzy doborem HLA, a ostatecznym wynikiem przeszczepu komplikuje się ponadto w zależności od tego, co uważamy za pomyślny wynik – przyjęcie przeszczepu, brak ciężkiej postaci choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (ang. Graft versus Host Disease – GvHD) czy czas przeżycia chorego. Musimy pamiętać, że brak przyjęcia przeszczepu nie jest największym zagrożeniem, ponieważ przeszczep można ponowić. Natomiast reakcja GvH (zwłaszcza nie ciężkiej jej postaci), u chorych z różnymi rodzajami białaczki, może mieć korzystny wpływ z uwagi na wywoływanie efektu przeszczep przeciwko białaczce – Graft-versus Leukemia (GvL). Bez takiego efektu u chorego może nastąpić nawrót choroby, a tym samym ostateczny efekt przeszczepu nie będzie osiągnięty. Reasumując, dobór HLA, wykonany nawet najdokładniej w zakresie istniejących możliwości na obecnym stanie wiedzy, nie daje pełnej gwarancji na pomyślny efekt kliniczny. Z drugiej strony dobór „niedoskonały” niekoniecznie musi się wiązać z porażką.

Do racjonalnego podejmowania decyzji czy komórki hemopoetyczne do danego dawcy mogą/powinny być przeszczepione potrzebna jest podstawowa znajomość budowy układu HLA, różnorodności antygenów, sposobów ich dziedziczenia oraz częstości najpopularniejszych antygenów. Dla lekarza praktyka konieczna jest też podstawowa wiedza o metodach oznaczania HLA, sposobie przedstawiania i interpretacji wyników oraz aktualnej nomenklaturze. W pracy przedstawimy też schemat postępowania dla doboru dawcy do przeszczepu oraz aktualne poglądy na istotność badań antygenów poszczególnych loci układu HLA.

Układ HLA jest najbardziej polimorficznym układem antygenowym człowieka (4, 6). Rozróżniamy dwie klasy antygenów: HLA I i HLA II. W obrębie każdej z nich występuje kilka wieloallelicznych układów antygenowych.

Wśród HLA klasy I istotne w transplantologii są: HLA-A, -B i -C. Liczbę antygenów i alleli w poszczególnych loci HLA I przedstawia tabela 1. Badania serologiczne pozwoliły na zdefiniowanie 24 swoistości antygenowych HLA-A, 49 swoistości HLA-B i 9 HLA-C. W tabeli 2 przedstawiono antygeny najczęściej spotykane wśród Słowian (6). Liczba opisanych alleli w każdym z wymienionych loci zwiększa się nieustannie z powodu ich poznawania przy pomocy coraz nowocześniejszych metod analizy DNA. Obecnie wynosi dla locus A 144, dla locus B – 286, a dla locus C – 80.

Wśród HLA klasy II antygeny kodowane przez trzy loci, HLA-DR, -DQ i -DP, mają znaczenie w transplantologii. Liczbę antygenów i alleli w obrębie każdego z nich przedstawia tabela 1. Metodami serologicznymi określono w ich obrębie 18 (DR); 9 (DQ) i 6 (DP) swoistości antygenowych. I tu liczba poznanych alleli definiowanych przy pomocy metod analizy DNA zwiększa się nieustannie. Opisano dotychczas 13 alleli genu DPA, 82 alleli DPB oraz 36 alleli DQB i 20 alleli DQA. Najczęściej występujące wśród Słowian (6) wymienione są w tabeli 2. Najbardziej polimorficzny jest locus HLA-DR. Mogą tu występować aż cztery funkcjonalne geny: DRB1, DRB3, DRB4 i DRB5. Pierwszy z tych genów, najbardziej polimorficzny występuje u wszystkich ludzi. Pozostałe mogą, lecz nie muszą mu towarzyszyć. Wyróżniono więc 5 haplotypów: DR51 (geny DRB1 i DRB5), DR52 (geny DRB1 i DRB3) i DR53 (geny DRB1 i DRB4) oraz haplotypy DR1 i DR8, w których występuje tylko gen DRB1.

Teoretycznie, antygen HLA kodowany przez każdy locus może występować na chromosomie z każdym innym z pozostałych loci, więc częstość wspólnego występowania poszczególnych swoistości mogłaby być obliczona z części wykrywania poszczególnych antygenów. I tak, jeśli antygen HLA-A1 występuje u 16% osób rasy kaukaskiej, a antygen HLA-B8 u 10% to odsetek osób posiadających haplotyp HLA-A1/B8 czyli takich, u których występują te dwa antygeny powinien wynieść 1,6%. Z niewiadomych przyczyn następuje nielosowe sprzężenie pewnych alleli różnych genów i co za tym idzie kombinacje pewnych antygenów są obserwowane w populacji częściej niż innych (zjawisko niezrównoważenia sprzężeń, ang. linkage disequlibrium). Wspomniany haplotyp A1/B8 występuje na przykład u około 8,8% ludzi rasy kaukaskiej. Podobnie, ścisłe sprzężenia istnieją pomiędzy swoistościami antygenów DR i DQ. Osoby o zgodnych antygenach HLA-A, -B i -DR mają więc dużą szansę być również zgodni w HLA-C i HLA-DQ. Najsilniejsze sprzężenia obserwuje się w obrębie antygenów HLA-DR gdzie określone swoistości antygenowe DR1-DR18 determinowane przez gen DRB1 występują łącznie z określonymi swoistościami DR51, DR52, DR53 determinowanymi przez pozostałe trzy geny. Znacznie częstsze występowanie pewnych haplotypów niż innych (tab. 3) ma duże implikacje praktyczne dla poszukiwania dawców do przeszczepów (6).

Biorąc pod uwagę tylko produkty genów loci HLA-A, -B i -DR liczba możliwych haplotypów wynosi ponad 2 x 10¹⁰. Z powodu tego, że częstość różnych antygenów jest różna, a dodatkowo istnieje zjawisko niezrównoważenia sprzężeń, prawdopodobieństwo znalezienia dwóch osób o zgodnych haplotypach zależy bardzo od tego jakie to są haplotypy. Dla tych chorych, u których antygeny będą występowały w „popularnych” sprzężeniach, znalezienie dawców zgodnych w HLA będzie łatwiejsze niż dla innych. Z kolei, dla niektórych chorych o rzadkich antygenach, występujących w unikalnych sprzężeniach, znalezienie zgodnego dawcy pod względem wszystkich antygenów HLA będzie praktycznie niemożliwe.

Metody serologiczne oznaczania antygenów HLA oparte są na teście mikrolimfocytoksycznym. W teście tym przeciwciała rozpoznają glikoproteiny antygenów HLA na powierzchni limfocytów i w obecności komplementu niszczą komórki z danym antygenem. Badania te mają duże ograniczenia spowodowane dostępnością surowic diagnostycznych. Liczba rozpoznawanych swoistości antygenowych będzie zawsze mniejsza od liczby alleli dających się zróżnicować przy pomocy analizy DNA (tab. 1). Niektóre części glikoprotein HLA, ze względu na strukturę trzeciorzędową cząsteczki, nie są bowiem dostępne dla przeciwciał diagnostycznych. Ponadto często, szczególnie u chorych na nowotwory krwi, napotyka się na trudności techniczne wynikające ze zbyt małej liczby limfocytów do badań, z zaburzeń ekspresji antygenów na powierzchni limfocytów, czy z uszkadzającego wpływu leków powodującego obumarcie limfocytów, niezależnie od działania surowic diagnostycznych (11). Niezwykle ważne jest wykonanie badania u chorego w takim okresie, by do minimum ograniczyć wpływ wymienionych czynników na wynik badań. Bardzo pomocne w interpretacji wyników HLA u chorych są badania rodzinne – dlatego też nawet w przypadkach gdy rodzice chorego nie są brani pod uwagę jako dawcy szpiku należy wykonać u nich badania HLA. Czasami, nawet mimo wykonania badań rodzinnych, oznaczenia HLA trzeba kilkakrotnie powtarzać. W badaniach HLA metodami serologicznymi błąd metody wynosi aż 15 do 30% (5). Szczególnie dotyczy to oznaczenia HLA klasy II. Dlatego, dla ich oceny, techniki serologiczne zastąpione są obecnie przez metody biologii molekukarnej. Badanie technikami serologicznymi stosuje się natomiast rutynowo do oznaczania antygenów HLA klasy I.

W badaniach tych stosowana jest reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), dzięki której namnaża się przy użyciu swoistych primerów fragmenty DNA poszczególnych genów układu HLA. Generalnie możliwe są tu dwa sposoby wykorzystania PCR (tab. 4).

W pierwszej grupie metod w jednej reakcji PCR namnaża się fragmenty DNA kodujące analizowany locus HLA osoby badanej, a następnie innymi metodami analizuje jakie allele w tym locus występują. Do tej analizy stosuje się różne techniki: hybrydyzację z sondami swoistymi dla alleli czy grup alleli (8, 20) (SSO – ang. sequence specific oligonucleotides), analizę restrykcyjną (PCR RFLP ang. restriction fragment lenght polymorphism), analizę konformacji cząsteczek DNA w drodze różnych technik elektroforetycznych (2, 7, 10, 17) (SSCP – single-stand conformation polymorphism, analiza hetero-dupleksów), czy techniki sekwencjonowania (10). Unowocześnioną odmianą technik analizy konformacji DNA jest tzw. badanie RSCA – reference stand conformational analysis (1), w którym przeprowadza się tworzenie heterodupleksów pomiędzy badanym DNA pacjenta, a znakowanym fluorescencyjnie DNA standardowym o znanej sekwencji. Technika bezpośredniego sekwencjonowania (SBT – sequence based typing) jest obecnie metodą z wyboru dla uzyskiwania wyników badań o wysokim stopniu rozdzielczości – określających allele występujące u osoby badanej (10, 18). Dodatkowo, technika ta ma wielkie możliwości dla poznawania nowych alleli HLA.

Drugi sposób wykorzystania PCR reprezentuje metoda PCR SSP (sequence specific primers) (14). Tu wykonuje się reakcje PCR z primerami swoistymi dla alleli lub grup alleli HLA. Dla uzyskania informatywnego wyniku trzeba wykonać ogromną liczbę reakcji PCR. Ich liczba zależy od stopnia polimorfizmu badanego locus i założonego stopnia rozdzielczości wyników, ale może dochodzić do kilkuset.

Wobec powszechnego stosowania metod biologii molekularnej z jednej strony, a trudności technicznych i interpretacyjnych dotychczas stosowanych metod komórkowych takich jak mieszana hodowla limfocytów czy cytoksyczność prekursorów limfocytów (3, 12) są one obecnie coraz rzadziej używane.

Stosując wyżej wymienione metody badań HLA możemy z różną dokładnością oznaczyć antygeny (tab. 5). Badanie metodą serologiczną definiuje swoistości serologiczne zapisywane nazwą locus i numerycznymi oznaczeniami antygenów np. HLA-A2, HLA-DR1 (uwaga! – nie DRB1, bo to jest nazwa genu w obrębie locus DR). Jeśli swoistość serologiczna nie jest ostatecznie potwierdzona w badaniach międzynarodowych na tzw. warsztatach (workshop) przed oznaczeniem liczbowym umieszczona jest litera „w” (np. HLA-Bw 42). Niektóre z antygenów mają wspólne tzw. determinanty antygenowe, co pozwala na określenie podtypów (ang. splits). Na przykład podtypami antygenu B12 są antygeny B44 i B45. W nawiasie, po numerze antygenu często dodaje się informację jakiego antygenu jest on podtypem np. B44 (12). Dodatkowo w obrębie locus B występują dwa tzw. epitopy powszechne – nadtypy: Bw4 i Bw6. Towarzyszą one różnym antygenom tego locus i ich określenie czasami pomaga w interpretacji wyniku testu.