Poznawanie mechanizmów oporności na leki jest jednym z najważniejszych kierunków prowadzonych obecnie badań nad nowotworami i metodami ich skutecznego leczenia.

Oporność na cytostatyki jest intensywnie badana od ponad trzydziestu lat. W 1968 r. Kessel i wsp. wykazali krzyżową oporność wyizolowanych komórek białaczkowych myszy na leki cytostatyczne (1), a w 1970 r. podobne wyniki uzyskali Biedler i Rhiem na komórkach białaczkowych chomika (2). W 1979 Goldie i Coldman przedstawili zaś matematyczny model tego zjawiska, oparty na fakcie, że komórki nowotworowe o dużej częstości spontanicznych mutacji szybko uodporniają się na określony lek. Uznali oni, więc, że aby zminimalizować skutki tego procesu celowe byłoby jednoczesne zastosowanie kilku leków o różnych punktach uchwytu i mechanizmach działania w obrębie komórki (3). Te i inne badania dały początek nowoczesnej polichemioterapii nowotworów.

Istnieje wiele podziałów lekooporności, wśród których najistotniejsze jest wyodrębnienie oporności pierwotnej, stwierdzanej przed poddaniem komórek nowotworowych działaniu chemio- i/lub radioterapii, oporności wtórnej, stymulowanej tymi metodami terapeutycznymi i innymi czynnikami fizycznymi i chemicznymi oraz oporności selektywnej i wielolekowej (4). Do chwili obecnej opisano kilkanaście mechanizmów oporności, z których najlepiej poznany jest proces usuwania leków z komórki i/lub jądra komórkowego przez błonowe białko transportowe, glikoproteinę P (P-gp), odkrytą w 1976 roku przez Juliano i Linga (5). P-gp jest syntetyzowana przez geny oporności wielolekowej (multidrug resistance genes, mdr), podzielone u człowieka na dwie klasy (6,7):

1. Gen mdr1 syntetyzujący błonowe białko transportowe.

2. Gen mdr2/mdr3 wykazujący 80% homologii do mdr1 i być może syntetyzujący białko spełniające również pewne funkcje transportowe (8).

Poszczególne białka różnią się między sobą liczbą i sekwencją aminokwasów.

Mdr1, zlokalizowany jest podobnie jak mdr2/mdr3 na chromosomie 7 (7q21), zawiera 28 egzonów, czyli kodujących odcinków DNA. Produktem genu mdr1 jest 6-pętlowy łańcuch białkowy wbudowany w błony komórkowe, składający się z 1280 aminokwasów tworzących dwie przezbłonowe domeny hydrofobowe TMD (transmembrane domains) 1 i 2 oraz dwie wiążące nukleotydy domeny hydrofilne, położone wewnątrzkomórkowo, NBD (nucleotide binding domains) 1 i 2. TMD odpowiadają za swoistość transportowanych substratów, a NBD za wiązanie i hydrolizę ATP (6, 9). Na rycinie 1 przedstawiono schematyczny model białkowego produktu genu mdr1.

Postać prekursorowa P-gp, tzw. pre-P-gp, jest białkiem o ciężarze 140kD pozbawionym właściwych funkcji. „Dojrzała” i aktywna Pgp (postać klasyczna), o ciężarze 170 kD, powstaje w wyniku kilku procesów: glikozylacji, fosforylacji oraz hydrolizy ATP. Drugi z wymienionych procesów jest następstwem pobudzenia kinazy C i prawdopodobnie także A, zależnej od cAMP (6).

Układ mdr1/P-gp występuje w prawidłowych komórkach narządów spełniających funkcje wydzielniczo-wydalnicze (śródbłonek naczyń mózgowych, ślinianki, tarczyca, kora nadnerczy, nabłonek oskrzelików płucnych, kanalików gruczołów mlekowych, kanalików żółciowych, proksymalnych kanalików nerkowych oraz nabłonek jelitowy, łożysko, jajniki, jądra) oraz w hematopoetycznych komórkach macierzystych (haematopoietic stem cells, HSC) i prawidłowych komórkach krwi obwodowej (limfocyty, granulocyty obojętnochłonne, monocyty) (10, 11). Siła ekspresji mdr1/P-gp jest różna w prawidłowych komórkach szpiku i krwi obwodowej: największa w HSC (w koekspresji z antygenem CD34) i naturalnych komórkach cytotoksycznych (natural killer cells, NK), mniejsza w limfocytach T, a najmniejsza, przy której P-gp traci aktywność pompy błonowej, w granulocytach obojętnochłonnych, limfocytach B i monocytach (12, 13).

P-gp należy do nadrodziny błonowych białek transportowych zależnych od ATP (ATP – binding casette proteins, ABC). Jest to kompleks białek regulujących dwukierunkowy transport przez błony zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe substratów egzogennych (m.in. węglowodanów, aminokwasów, peptydów i białek, kwasów tłuszczowych, syntetycznych i naturalnych toksyn, jonów metali) i endogennych (m.in. hormonów sterydowych, bilirubiny i cytokin), związków o właściwościach lipofilnych i hydrofobowych.

Dotychczas wyodrębniono w organizmie człowieka 51 genów kodujących białka ABC (7 podrodzin różniących się sekwencją aminokwasów oraz liczbą i organizacją przezbłonowych domen TMD i domen wiążących nukleotydy NBD) spośród ponad 100 stwierdzanych w organizmach procaryota (organizmy nie posiadające jądra komórkowego – bakterie i sinice) i eucaryota (organizmy wyższe). U człowieka mutacje w obrębie tych genów są przyczyną chorób uwarunkowanych genetycznie, m.in.: mukowiscydozy, zespołów neurologicznych, zwyrodnienia siatkówki, zaburzeń w przemianach cholesterolu i żółci, a także niektórych niedokrwistości (4, 6, 8, 14, 15, 16).

100-krotne wzmożenie siły ekspresji mdr1/P-gp w stosunku do obserwowanego w prawidłowych komórkach o najsilniejszej ekspresji objawia się opornością na leczenie stosowane w nowotworach układu krwiotwórczego (wszystkie typy ostrych i przewlekłych białaczek, białaczka włochatokomórkowa, ziarnica złośliwa, chłoniaki nieziarnicze, szpiczak plazmocytowy), zespołach mielodysplastycznych oraz w nowotworach innych układów i narządów zawierających komórki, w których stwierdza się fizjologiczne występowanie mdr1/P-gp.

Kilkanaście lat po odkryciu P-gp zaczęły się pojawiać doniesienia o innych białkach – opisane w 1992 r. „białko związane z opornością wielolekową” (multidrug resistance – associated protein, MRP1), w 1993 r. „białko związane z opornością w płucach” (lung resistance-related protein, LRP) i ostatnio, w 1998 r., „białko oporności raka sutka” (breast cancer resistance protein, BCRP) – odpowiedzialnych za wypłukiwanie leków z komórek nowotworowych i wynikającą stąd oporność na leczenie w chorobach nowotworowych układu krwiotwórczego oraz innych układów i narządów. MRP i BCRP, podobnie jak P-gp, należą do nadrodziny ABC, a różnią się jedynie budową cząsteczki, konkretnie liczbą TMD i NBD.

Białko spełnia funkcje transportowe, jeśli składa się z co najmniej 2 TMD i 2 NBD i stanowi tzw. pełny transporter (P-gp i MRP1). Natomiast półtransportery zawierają 1 TMD i 1 NBD, a aktywność pompy ATP-zależnej uzyskują tworząc dimery (9, 14). Takim białkiem jest BCRP.

Spośród 6 dotychczas poznanych białek MRP odpowiedzialnych za transport anionów organicznych (multispecific organic anion transporter, MOAT), w tym sprzężonych z glutationem, kwasem glukuronowym i siarkowym najlepiej poznane jest MRP1. Jest to białko o masie 190 kD zawierające charakterystyczną dodatkową, poza TMD1,2 i NBD1,2 glikozylowaną domenę przezbłonową TMD0 na końcu N- łańcucha białkowego, syntetyzowane przez gen mrp1 zlokalizowany na chromosomie 16 (16p13) (17).

Ekspresję układu mrp1/MRP1 stwierdza się we wszystkich, prawidłowych i nowotworowych komórkach układu krwiotwórczego (spośród prawidłowych – największą w limfocytach T) oraz innych układów i narządów. Największą ekspresję, wywołującą oporność na leczenie w chorobach nowotworowych układu krwiotwórczego, obserwuje się w przewlekłej białaczce limfatycznej i w ostrej białaczce nielimfoblastycznej (OBNL), mniejszą w ostrej białaczce limfoblastycznej (OBL), przewlekłej białaczce szpikowej, chłoniakach ziarniczych i nieziarniczych oraz w szpiczaku plazmocytowym (17, 18, 19). Leki cytostatyczne będące substratami MRP1 są sprzęgane głównie z glutationem i aktywnie usuwane z komórki. W tabeli 1 przedstawiono sprzęgane substraty MRP1.

MRP1 jest również głównym transporterem innego anionu organicznego – metotreksatu (20). Natomiast ostatecznie nie rozstrzygnięto, czy oporność na mitoksantron jest zależna od aktywności MRP1 (21).

BCRP o masie 72,6kD, kodowane przez gen zlokalizowany na chromosomie 4 (4q22), jest najmniej poznane. Silną ekspresję bcrp/BCRP stwierdzono w prawidłowych komórkach łożyska, jelita cienkiego i grubego oraz wątroby. Spełnia ono funkcje fizjologiczne jako białko należące do kompleksu ABC, ale wydaje się, że ma ono również wpływ na wyniki leczenia chorób nowotworowych m.in. układu krwiotwórczego, głównie OBNL (14, 22, 23, 24) i jest odpowiedzialne za transport błonowy kilku leków przeciwnowotworowych: daunorubicyny, doksorubicyny, mitoksantronu oraz topotekanu (25).

Natomiast LRP stanowi 70% kompleksu rybonukleoproteinowego (większe białko krypt – major vaults protein, MVP) i jest podstawową jednostką białkową krypt, organelli komórkowych zdolnych do szybkiego i swobodnego ruchu w cytoplazmie, odpowiadających za transport z jądra komórkowego i sekwestrację leku przeciwnowotworowego (26). Krypty występują w prawidłowych komórkach, a przemiany nowotworowe powodują zmiany w ekspresji układu lrp/LRP. Jego nadekspresja, głównie w OBNL, szpiczaku plazmocytowym, chłoniakach nieziarniczych i zespołach mielodysplastycznych, jest przyczyną oporności na zastosowane w leczeniu: daunorubicynę, doksorubicynę, mitoksantron, winkrystynę, melfalan, etopozyd, cisplatynę, karboplatynę, L-asparaginazę (23, 26). Gen kodujący białko LRP o masie 110kD 2 znajduje się, podobnie jak mrp1, na chromosomie 16 (16p11) (27).

Podkreśla się niekorzystny wpływ pewnych mechanizmów oporności na wyniki leczenia i przebieg ostrych białaczek, w OBNL – głównie mdr1/P-gp, mrp1/MRP1, lrp/LRP (28, 29, 30, 31), a w OBL – mdr1/P-gp (32, 33), zwracając szczególną uwagę na wyniki testów czynnościowych oceniających funkcje P-gp i MRP1 w OBNL (29, 34) i P-gp w OBL (33). W badaniu SWOG (South West Oncology Group) na dotychczas największej grupie 352 chorych na OBNL de novo stwierdzono, że tylko koekspresja i aktywność kilku, a nie każdego z osobna, mechanizmów oporności na leczenie (P-gp, MRP1, LRP), miała negatywny wpływ na przebieg choroby. Związek występowania ekspresji mdr1/P-gp u chorych na OBNL z wiekiem, niekorzystnymi zmianami cytogenetycznymi oraz ekspresją antygenu CD34 na komórkach białaczkowych, potwierdzono w wielu publikacjach (28, 29, 30, 35, 36, 37). Odsetek chorych na OBNL z tymi niekorzystnymi czynnikami rokowniczymi, nie odpowiadających na leczenie indukujące jest wysoki i wynosi 40-56% (35, 38).

W kilku publikacjach podkreśla się związek dobrych wyników terapii antracyklinami w OBNL M3 i możliwość uzyskania długotrwałych remisji u ponad 70% chorych z brakiem lub bardzo słabą ekspresją mdr1/P-gp, mrp1/MRP1 i lrp/LRP, co jest charakterystyczne dla tego typu białaczki (28, 39, 40).

W badaniach genów oraz ich produktów (białek) stosowane są metody jakościowe, ilościowe i czynnościowe. Dobór metody zależy m.in. od rodzaju materiału przeznaczonego do badania (wycinki guzów litych, szpik, krew, płyny ustrojowe) i możliwości diagnostycznych danego laboratorium. Wskazane jest, aby w badaniach lekooporności uwzględniać jak najwięcej mechanizmów ją powodujących z uwagi na to, że w przypadku braku odpowiedzi na zastosowane leczenie (pierwotna oporność na terapię) najpowszechniej badany układ mdr1/P-gp może być niewykrywalny lub niefunkcjonujący jako pompa błonowa w komórkach nowotworowych, a za niepomyślny wynik leczenia odpowiada inny mechanizm.

a) Hybrydyzacja z zastosowaniem swoistych sond wykrywających poszukiwaną, nie amplifikowaną sekwencję DNA lub RNA.

Należą tu:

– fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (fluorescence hybridisation in situ, FISH), wykrywająca nie amplifikowany gen mdr1,

– southern blot- DNA,

– northern blot- RNA,

wykonywane różnymi technikami (m.in. Slot blot, Dot blot).

b) Łańcuchowa reakcja polimerazy (polymerase chain reaction, PCR).

a) Hybrydyzacja:

– western blot.

b) Metody immunologiczne, z zastosowaniem swoistych, odpowiednio znakowanych przeciwciał:

– cytometria przepływowa (flow cytometry, FC),

– badania immunocytochemiczne (immunocytochemical, ICC), z możliwością wykonania badania cytologicznego,

– badania immunohistochemiczne (immunohistochemical, IHC), z równoczesnym badaniem histopatologicznym materiału diagnostycznego.

W ostatnich latach najczęściej stosowanymi metodami wykrywania markerów oporności są badania różniące się swoistością i czułością – FC i ICC (większa swoistość) oraz RT-PCR (większa czułość).

Oznaczanie immunofenotypu komórek nowotworowych umożliwia ich wyodrębnienie z całej populacji, określenie stopnia ich dojrzałości i zróżnicowania oraz ocenę jakościową, ilościową i czynnościową markerów oporności w uzyskanej „czystej” subpopulacji. W badaniu tym są stosowane swoiste przeciwciała monoklonalne sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi: fikoerytryna (phycoerythrin, PE) i tioizocyjanianu fluoresceiny (fluorescein isothiocyanate, FITC), reagujące z epitopami błonowym i cytoplazmatycznymi. Wskazane jest zastosowanie przy badaniu każdej próbki materiału diagnostycznego co najmniej dwóch przeciwciał o jak największej swoistości, reagujących z dwoma różnymi epitopami błonowymi i/lub cytoplazmatycznymi (m.in. w celu uniknięcia możliwości reakcji przeciwciała z białkiem będącym produktem genu mdr2/mdr3)(41, 42).