© Borgis - Anestezjologia Intensywna Terapia 4/2006, s. 207-211
*Wojciech Dąbrowski1, Andrzej Nestorowicz1, Anna Korycińska2, Jacek Roliński2
Zmiany natężenia apoptozy limfocytów u chorych poddanych zabiegom pomostowania naczyń wieńcowych
Lymphocyte apoptosis during coronary artery bypass graft surgery
1Katedra i I Klinika Anestezjologii i Intensywnej Terapii AM w Lublinie
kierownik: prof. dr hab. n. med. A. Nestorowicz
2Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej AM w Lublinie
kierownik: prof. dr hab. n. med. J. Roliński
Summary
Background.Apoptosis is one of the main types of programmed cell death, proceeding in an ordered process that generally confers advantages during an organism´s life cycle. Beside other apoptotic signals in lymphocyte injury, the decrease of mitochondrial transmembrane potential is regarded as the earliest and non-reversible.
The aim of the study was to analyse the mitochondrial transmembrane potentials of lymphocytes in adult patients undergoing coronary artery bypass grafting (CABG).
Methods. Twenty male patients, scheduled for CABG, were enrolled in the study. The changes of mitochondrial transmembrane potentials were measured at the following measurement points: 1. Immediately after radial artery cannulation; 2. During extracorporeal circulation and lowest hypothermia; 3. Immediately after surgery before transportation to the ICU; 4. In the evening of the day of surgery; 5. On the morning of the first postoperative day; 6. In the evening of the first postoperative day; and 7. On the morning of the second postoperative day. The CMXRos (chloromethyl-X-rosamine) and flow cytometric methods were used for biochemical analysis.
Results. A significant increase in apoptotic lymphocytes was noted between the second and seventh measuring points. The highest number was noted at the second, third and fourth measurement point. The number decreased on the morning of the first postoperative day and subsequently increased again.
Discussion. It is not clear whether the observed increases in apoptosis was caused by the surgery, anaesthetic agents (isoflurane, fentanyl), inotropic agents, or a combination of various factors. It is also difficult to explain the reason for the two-phase intensity of the apoptotic process.
Conclusions. 1. CABG increased peripheral blood lymphocyte apoptosis. 2. The highest values were no-ted in the evening immediately after surgery and during the first two postoperative days.
Apoptoza jest złożonym, zaprogramowanym i biochemicznie kontrolowanym procesem samozniszczenia komórki. Rozwija się ona najczęściej na skutek uszkodzenia lub zaburzenia funkcji komórki, które może być efektem działania zarówno czynnika zewnętrznego jak i wewnętrznego. Charakterystyczną cechą apoptozy są zmiany biochemiczne i ultrastrukturalne. Należy do nich m.in. spadek potencjału elektrochemicznego pomiędzy błonami mitochondrialnymi, który uważany jest za jeden z pierwszych i zarazem nieodwracalnych wskaźników apoptozy [1, 2].
Mitochondria są organellami odpowiedzialnymi za procesy oddechowe. Są one zbudowane z matrycy mitochondrialnej (matrix) otoczonej wewnętrzną błoną mitochondrialną oraz przestrzeni międzybłonowej, którą od cytoplazmy oddziela zewnętrzna błona mitochondrialna. Istotnymi składnikami wewnętrznej błony mitochondrialnej są: syntetaza ATP, translokator adenozyny oraz kanały elektronowe. Składniki te w warunkach fizjologicznych utrzymują elektrochemiczny gradient napięć, którego nagłe zaburzenia mogą prowadzić do samozniszczenia komórki. Podobny gradient występuje również na zewnętrznej błonie mitochondrialnej, za który są kolei odpowiedzialne liczne napięciowo zależne kanały anionowe. Ważną rolę w patomechanizmie apoptozy odgrywa również przestrzeń międzybłonowa, której zawartość stanowią: cytochrom c, prokaspaza, kinaza adenylowa 2 oraz czynnik indukujący apoptozę [1]. Zaburzenia przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej sprzyjają uwolnieniu wymienionych substancji, szczególnie cytochromu c do cytozolu mitochondrium, rozpoczynając proces apoptozy komórki [1, 2]. Proces ten nie jest do końca poznany, zwłaszcza w przypadkach, gdy jest on skutkiem złożonych procedur do jakich można zaliczyć krążenie pozaustrojowe.
Celem pracy była ocena stopnia natężenia apoptozy limfocytów, mierzonego zmianami ich przezbłonowego potencjału mitochondrialnego u chorych poddanych zabiegom pomostowania naczyń wieńcowych w krążeniu pozaustrojowym.
Metodyka
Po uzyskaniu zgody Komisji Bioetyki przy AM w Lublinie oraz świadomej zgody chorych, do badań zakwalifikowano osoby poddane chirurgicznej rewaskularyzacji mięśnia sercowego w krążeniu pozaustrojowym z powodu stabilnej choroby wieńcowej stopnia I lub II wg skali CCS ( Canadian Cardiovascular Society). Z badań wykluczono chorych leczonych w przeszłości z powodów endokrynologicznych, neurologicznych oraz poddanych zabiegom resuscytacyjnym z uwagi na zatrzymanie krążenia. Do badań nie zostały również włączone osoby podające w wywiadzie choroby o podłożu alergicznym.
W przeddzień operacji wieczorem badani otrzymywali doustnie 2 mg lorazepamu oraz domięśniowo 50 mg prometazyny. Jedną godzinę przed rozpoczęciem anestezji wszyscy chorzy otrzymywali doustnie 3 mg lorazepamu i domięśniowo 0,1 mg kg-1 morfiny. U wszystkich zastosowano znieczulenie ogólne z użyciem fentanylu w dawce 0,01-0,02 mg kg-1, midazolamu 0,05-0,1 mg kg-1, oraz etomidatu w dawce 0,1-0,5 mg kg-1, zaś zwiotczenie mięśniowe uzyskiwano przy pomocy pankuronium 0,08-0,1 mg kg-1. Znieczulenie podtrzymywano ciągłym dożylnym wlewem fentanylu i midazolamu oraz frakcjonowanymi dawkami izofluranu podawanego drogą wziewną w stężeniu 0,5-1%. W trakcie znieczulenia i operacji stosowano mechaniczną wentylację płuc w trybie IPPV mieszaniną tlenu i powietrza w stosunku 1:1, pod kontrolą ustalonych parametrów wentylacyjnych: VT – 10 ml kg-1, f – 9 min-1, ciśnienia szczytowego wdechu – 18 mm Hg (2,4 kPa). W trakcie wszczepiania pomostów aortalno-wieńcowych krążenie i wentylację podtrzymywano przy pomocy aparatu płuco-serce S III (firmy Stöckert, USA). Do pierwotnego wypełnienia pompy (priming) zastosowano: roztwór Ringera – 1000 ml, 6% roztwór hydroksyetylowanej skrobi – 500 ml, 20% mannitol – 250 ml, wodorowęglan sodowy – 20 ml oraz heparynę w dawce 75 mg. Kardiopleginę przygotowywano na bazie 0,9% roztworu soli kuchennej uzupełnionego 3 g chlorku potasu i 20 ml wodorowęglanu sodowego.
Badania przeprowadzano w siedmiu etapach procedury: 1) po kaniulacji tętnicy promieniowej przed rozpoczęciem znieczulenia i operacji (wartości wyjściowe), 2) w trakcie najgłębszej hipotermii, 3) po zakończonej operacji przed przewiezieniem chorego do OIOP, 4) wieczorem w zerowej dobie pooperacyjnej (12 h po rozpoczęciu operacji), 5) rano w pierwszej dobie pooperacyjnej (24 h po rozpoczęciu operacji), 6) wieczorem w pierwszej dobie pooperacyjnej (36 h po rozpoczęciu operacji) oraz 7) rano w drugiej dobie pooperacyjnej (48 h po rozpoczęciu operacji).
Krew do badań pobierano z tętnicy promieniowej, wirowano a wyizolowane komórki inkubowano z CMXRos w temperaturze 37°C przez 15 min. Analizy przezbłonowego potencjału mitochondrialnego limfocytów dokonywano przy pomocy chlorometyl-X-rosaminy CMXRos (Mito Tracker Red CMXRos, Molecuar Probes) i przeciwciała monoklonalnego przeciw glikoforynie A, sprzężonego z izotiocyjaninem fluoresceiny (FITC – Dako, Dania). Uzyskany materiał oceniano w cytometrze przepływowym.
Wyniki poddano obliczeniom statystycznym przy użyciu testu Wilcoxona przyjmując za istotne p<0,05.
Wyniki
Badaniami objęto 20 mężczyzn w wieku od 53 do 70 lat (61,1±6,9). Szesnastu chorych przebyło zawał mięśnia sercowego w okresie 3 lat poprzedzających zabieg zaś osiemnastu było leczonych z powodu nadciśnienia tętniczego I° lub II° według skali WHO.
Średni czas operacji wynosił 205±35 min, a znieczulenia 235±30 min. U wszystkich badanych aortę zaciskano w sposób typowy, zaś średni czas zamknięcia aorty wynosił 45,1±15,5 min. Zespolenia aortalno-wieńcowe wykonywano w łagodnej hipotermii – 34,5±0,4°C. U wszystkich chorych odłączenie od aparatu płuco-serca odbyło się bez powikłań, jak również nie zachodziła konieczność stosowania kontrapulsacji wewnątrzaortalnej.
W badanej grupie sześciu chorych nie wymagało farmakologicznego wspomagania układu krążenia, siedmiu otrzymało wlew dopaminy w dawkach zależnych od stanu klinicznego (7,3±3,8 mg kg-1 min-1), zaś u siedmiu stosowano dobutaminę (5,7±2,5 mg kg-1 min-1). U wszystkich badanych przebieg pooperacyjny był niepowikłany.
Procedura krążenia pozaustrojowego powodowała systematyczny wzrost apoptozy limfocytów, który utrzymywał się przez cały okres obserwacji. Najwyższe jej wartości notowano wieczorem po zakończonym zabiegu – w 4 etapie, po czym występował jej spadek (etap 5) a następnie ponowny wzrost w 6 i 7 etapie badań (ryc. 1).
Ryc. 1. Apoptoza limfocytów (%) u badanych chorych.
** oraz *** – zmiany istotne w porównaniu do wartości etapu 1;
??? – zmiany istotne w porównaniu do wartości etapu 4;
oo – zmiany istotne w porównaniu do wartości etapu 5.
Dyskusja
Proces samozagłady komórek nie jest do końca jednoznacznie określony i chociaż wiadomo, że pełni on znamienną rolę w utrzymywaniu homeostazy ustroju, to jednak jego przyczyny i patomechanizm są nadal tematem wielu badań klinicznych [3, 4, 5, 6, 7]. Złożony charakter procedury krążenia pozaustrojowego, jak również stosowana nierzadko śród- i pooperacyjnie agresywna terapia zaburzeń hemodynamicznych nasilają apoptozę komórek, co może powodować rozwój niewydolności narządowej [3]. Nie bez wpływu na omawianą patologię mają też stosowane podczas znieczulenia halogenowe środki wziewne, opioidy czy też niedepolaryzujące środki zwiotczające [4, 5].
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Gupta S:Molecular steps of death receptor and mitochondrial pathways of apoptosis. Life Sciences 2001; 69: 2957-2964.
2. Gupta S:Molecular steps of cell suicide: an insight into immune senescence. J Clin Immunol 2000; 20: 229-239.
3. Delogu G, Moretti S, Antonucci A, Marcellini S, Masciangelo R, Famularo G, Signore L, De Simone C: Apoptosis and surgical trauma. Arch Surg 2000; 135: 1141-1147.
4. Oka M, Hirazawa K, Yamamoto K, Iizuka N, Hazaman S, Suzuki T, Kobayashi N: Induction of Fas-mediated apoptosis on circulating lymphocytes by surgical stress. Ann Surg 1996; 223: 434-440.
5. Matsuoka H, Kurosawa S, Horinouchi T, Kato M, Hashimoto Y: Inhalated anesthetics induce apoptosis in normal peripherial lymphocytes in vitro. Anesthesiology 2001; 95: 1467-1472.
6. Delogu G, Moretti S, Antonucci A, Marandola M, Tellan G, Sale P, Carnevali R, Famularo G: Apoptogenic effect of fentanyl on freshly isolated peropherial blood lymphocytes. J Trauma 2004; 57: 75-81.
7. Delogu G, Moretti S, Famularo G, Marcellini S, Santini G, Antonucci A, Marandola M, Signore L: Mitochondrial perturbations and oxidant stress in lymphocytes from patients undergoing surgery and general anesthesia. Arch Surg 2001; 136: 1190-1196.
8. Mooren FC, Lechtermann A, Fromme A, Thorwesten L, Volker K: Alterations in intracellular calcium signaling of lymphocytes after exhaustive exercise. Med Sci Sports Exerc 2001; 33: 242-248.
9. Pedersen BK, Rohde T, Ostrowski K: Recovery of the immune system after exercise. Acta Physiol Scand 1998; 162: 325-332.
10. Mooren FC, Blöming D, Lechtermann A, Lerch MM, Völker K: Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J Appl Physiol 2002; 93: 147-153.
11. Hoffman-Goetz L, Zajchowski S: In vitro apoptosis of lymphocytes after exposure to levels of corticosterone observed following submaximal exercise. J Sports Med Phys Fitness 1999; 39: 269-274.
12. Mars M, Govender S, Weston A, Naicker V, Chuturgoon A: High intensity exercise: a cause of lymphocyte apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 1998; 249: 366-370.
13. Oberbeck R, Schmitz D, Wilsenack K, Schuler M, Pechle B, Schedlowski M, Exton MS: Adrenergic modulation of survival and cellular immune functions during polymicrobial sepsis. Neuroimmunomodulation 2004; 11: 214-223.
14. Cosentio M, Rasini E, Colombo C, Marino F, Blandini F, Ferrari M, Samuele A, Lecchini S, Nappi G, Frigo G: Dopaminergic modulation of oxidative stress and apoptosis in human peripheral blood lymphocytes: evidence for a D1-like receptor-dependent protective effect. Free Radic Biol Med 2004; 36: 1233-1240.
15. Stevenson JR, Westermann J, Liebmann PM, Hortner M, Rinner I, Flesner P, Wolfer A, Schauenstein K: Prolonged alpha-adrenergic stimulation causes changes in leukocyte distribution and lymphocyte apoptosis in the rat. J Neuroimmunol 2001; 120: 50-57.
16. Cioca DP, Watanabe N. Isobe M:Apoptosis of peripherial blood lymphocytes is induced by catecholamines. Jpn Heart J 2000; 41: 385-398.
17. Lang PA, Kaiser S, Myssina S, Wieder T, Lang F, Huber SM: Role of Ca+2-activated channels in human erythrocyte apoptosis. Am J Physiol Cell Physiol 2003; 285: C1553-C1560.
18. Maeno E, Ishizaki Y, Kanaseki T, Hazama A, Okada Y:Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis. Proc Natl. Acd. Sci. USA 2000; 97: 9487-9492.
19. Satur CM, Anderson JR, Jennings A, Newton K, Martin PG, Nair U, Walker DR: Magnesium flux caused by coronary artery bypass operation: three patterns of deficiency. Ann Thorac Surg 1994; 58: 1674-1678.
20. Korycińska A, Dąbrowski W, Dragan M, Pożarowski P, Biernacka J, Stążka J, Roliński J: The degree of lymphocytic apoptosis during coronary artery bypass graft procedure and normovolemic haemodilution. Pol J Environm Studies 2005; 14: 223-227.
21. Cowger NL, O´Connor KC, Hammond TG, Lacks DJ, Navar GL:Characterization of bimodal cell death of insect cells in rotating-wall vessel and shaker flask. Biotechnol Bioeng 1999; 64: 14-26.
