W procesach fizjologicznych organizmu np. w łańcuchu oddechowym, w reakcjach autooksydacji wielu związków chemicznych, w procesach fagocytozy, w enzymatycznych przemianach kwasu arachidonowego, powstają wolne rodniki tlenowe (26). Nie tylko podstawowy metabolizm komórki, ale również aktywność biologiczna wielu egzogennych związków chemicznych (leków, ksenobiotyków) i czynników fizycznych (promieniowanie jonizujące, UV, termiczne) jest przyczyną tworzenia się wolnych rodników (27, 46, 59, 75).

W licznych badaniach udowodniono udział wolnych rodników w procesach wzrostu, różnicowania, rozwoju i śmierci komórek organizmu (27). Obecność wolnych rodników i innych pochodnych tlenu (np. O^2- i H₂O₂) jest konieczna w procesach, takich jak wewnątrzkomórkowe przekazywanie sygnału czy fagocytoza (46).

Wolne rodniki uczestniczą w metabolizmie i działaniu cytotoksycznym niektórych leków antynowotworowych (np. doxorubicyny, daunorubicyny i ich analogów), stosowanych w terapii wielu nowotworów np. raku płuc, piersi i jajników (29). Efekt cytotoksycznego działania tych związków w nowotworowych komórkach jest związany nie tylko ze zmianami jakie zachodzą w strukturze DNA na skutek interkalacji czy alkilacji, ale również poprzez wytwarzanie wolnych rodników tlenowych (anionu ponadtlenkowego, rodnika hydroksylowego) i innych aktywnych form tlenu (np. nadtlenku wodoru) (20).

Zaburzenie fizjologicznej równowagi pomiędzy produkcją reaktywnych form tlenu i ich unieczynnianiem prowadzi do stanu szoku tlenowego/stresu oksydacyjnego. Zwiększona produkcja wolnych rodników w komórce występująca w stanach zaburzonego metabolizmu, niedotlenienia lub niedokrwienia prowadzi do uszkodzenia podstawowych struktur komórkowych. Mechanizmy prowadzące do uszkodzenia komórek obejmują ich działanie na lipidy, białka i DNA (75). Ostatecznymi skutkami działania wolnych rodników tlenowych w komórkach organizmu są: mutacje, metaboliczne dysfunkcje, starzenie. Te z kolei są przyczyną rozwoju procesów zapalnych, nowotworów oraz zaburzeń funkcji licznych narządów (serca, wątroby, nerek, płuc i innych) (41).

Organizmy żywe wytworzyły wiele mechanizmów obronnych umożliwiających prawidłowe funkcjonowanie komórek w obecności aktywnych form tlenu. Jednym z elementów tego systemu jest odpowiednia organizacja strukturalna komórek, która zapewnia izolację miejsc, gdzie powstają wolne rodniki. Ochronną funkcję przed szkodliwym działaniem wolnych rodników tlenowych oraz nadtlenku wodoru pełnią również enzymy komórkowe (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza i reduktaza glutationowa) oraz nieenzymatyczne przeciwutleniacze i zmiatacze wolnych rodników (np. kwas moczowy, tokoferol, kwas askorbinowy, glutation, jony metali, bilirubina, cysteina i inne) (27, 46). Prawidłowe działanie obu układów antyoksydacyjnych jest niezwykle istotnym czynnikiem zapewniającym właściwe funkcjonowanie organizmu (53, 61). Enzymatyczny system unieczynniania reaktywnych rodników tlenu jest wspomagany przez istniejące w komórce systemy naprawy uszkodzeń oksydacyjnych. Przed skutkami działania wolnych rodników chronią organizm również naturalne i syntetyczne związki egzogenne o właściwościach antyoksydacyjnych, np. kwas askorbinowy, a-tokoferol, b-karoten, związki polifenolowe (47).

W organizmach aerobowych w wyniku stopniowej redukcji O₂ powstają reaktywne formy tlenu. W reakcji jednoelektronowej redukcji O₂ powstaje rodnik ponadtlenkowy O₂. Wiele enzymów oksydoredukcyjnych w trakcie katalizowanych przez siebie reakcji wytwarza rodnik ponadtlenkowy (np. dioksygenaza tryptofanowa i oksydaza ksantynowa, cytochrom P-450). Rodnik ponadtlenkowy wytwarzany jest również w reakcjach autooksydacji wielu związków występujących w komórkach (np. adrenaliny, ferrodoksyny, flawin), w procesach transportu elektronów u bakterii, w chloroplastach, mitochondriach, mikrosomach, retikulum endoplazmatycznym roślin i zwierząt, podczas „wybuchu oddechowego” komórek fagocytujących (46, 75).

Chemiczna natura rodnika ponadtlenkowego, stosunkowo długi „czas życia”, łatwa dyfuzja z miejsca powstania do innych struktur komórkowych wyjaśnia mechanizm modyfikacji i uszkodzeń białek, kwasów nukleinowych i lipidów, co z kolei prowadzi do znacznych zmian w metabolizmie komórkowym (25). W białkach rodnik utlenia grupy SH do S-S. Powoduje to zmiany konformacyjne i często prowadzi do inaktywacji kluczowych enzymów metabolizmu komórek (32). Oksydacyjne modyfikacje białek, lipidów i DNA z udziałem rodnika ponadtlenkowego zostały udokumentowane w licznych pracach doświadczalnych (27). Rodnik ponadtlenkowy łatwo reagując z jonami metali (Cu⁺², Fe ⁺³), które są kofaktorami wielu reakcji enzymatycznych zmienia ich stopień utleniania i tym samym wprowadza duże zmiany w potencjale oksydacyjno-redukcyjnym komórki (9).

W układach biologicznych rodnik ponadtlenkowy ulega dysmutacji do H₂O₂.

O₂ + O₂ + 2H⁺ H₂O₂

Szybkość reakcji dysmutacji zależy od pH środowiska. Znacznie szybciej przebiega w niskim pH, a wolniej w naturalnym środowisku komórki. Generalnie jednak w naturalnym środowisku komórek nadmiar rodnika ponadtlenowego jest eliminowany przez działanie dysmutazy ponatlenkowej zaliczanej do klasy oksydoreduktaz (E.C. 1.15.1.1).

Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) występuje we wszystkich tkankach metabolizujących tlen (25), jest metaloproteiną zawierającą w swych centrach aktywnych jony metali (Fe, Cu, Zn, Mn) (15). W komórkach ludzkich znajdują się trzy formy SOD: cynkowo-miedziowa (CuZnSOD) w cytozolu i przestrzeni międzybłonowej mitochondriów, manganowa (MnSOD) prawie wyłącznie w mitochondriach i dysmutaza pozakomórkowa (ECSOD) (26, 33). Wszystkie izoenzymy SOD u ludzi są kodowane przez geny jądrowe, syntetyzowane w cytoplazmie i transportowane do odpowiednich kompartmentów komórkowych.

Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) jest istotnym elementem obrony komórek przed toksycznym działaniem wolnych rodników tlenowych. Przyspiesza ona rozkład rodnika ponadtlenkowego O₂:

2O₂ + 2H⁺ H₂O₂ + O₂

Jest to możliwe dzięki szczególnej budowie i konformacji tego enzymu.

Budowa podjednostkowa CuZnSOD i MnSOD została dokładnie poznana i szczegółowo opisana w licznych pracach naukowych. CuZnSOD jest homodimerem, o masie około 35 kDa, natomiast MnSOD jest tetramerem o masie około 80 kDa (3, 26, 71, 76). Gen dla MnSOD jest zlokalizowany na chromosomie 6 (76), natomiast dla CuZnSOD na chromosomie 21 (44).

Wolne rodniki są zaangażowane w każdym etapie procesu kancerogenezy. Wiadomo jakie uszkodzenia wprowadzają do cząsteczki DNA i jakie są tego skutki. W licznych badaniach komórek nowotworowych wykazano obniżony poziom aktywności enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPx), katalazy (CAT), transferazy glutationowej (GST) (59, 70). Najczęściej stwierdzano obniżenie aktywności MnSOD i CuZnSOD (51). Aktywność obu izoform SOD zależała od stężenia w komórce jonów manganu, cynku i miedzi (48). Na podkreślenie zasługuje fakt, że zmianom aktywności SOD towarzyszą zmiany aktywności innych enzymów antyoksydacyjnych stanowiących barierę antyoksydacyjną w komórce. Zmiana aktywności jednego z nich zakłóca stan równowagi pomiędzy systemem antyoksydacyjnym a ilością wolnych rodników, co może prowadzić do powstawania zmian nowotworowych (59, 75).

Za najważniejszy enzym obronny komórek przed stresem oksydacyjnym uważana jest mitochondrialna MnSOD. Najbardziej podatną strukturą komórki na oksydacyjny atak wolnych rodników są mitochondria. Generowane tu wolne rodniki uszkadzają słabo zabezpieczony DNA, co prowadzi do mutacji, które powodują powstawanie deficytu energetycznego komórek i rozwój zmian nowotworowych (69). Zabezpieczenie genomu mitochondrialnego przed działaniem reaktywnych form tlenu zapewnia sprawnie działająca MnSOD, która chroni komórki organizmu przed poważnymi konsekwencjami metabolicznymi (25).

Bardzo często brak lub słaba aktywność MnSOD jest wiązana z powstawaniem zmian nowotworowych u ludzi (59). Z kolei wzrost aktywności MnSOD wiąże się z postępującym rozwojem choroby nowotworowej i stopniowym złośliwieniem komórek nowotworowych (39, 67). Nadekspresja MnSOD wyrażona wzrostem aktywności tego enzymu w komórkach zmniejsza ilości rodnika ponadtlenkowego i znosi fenotyp nowotworowy (12). Równocześnie nadekspresja MnSOD w komórkach nowotworowych chroni je przed cytotoksycznym działaniem TNF-a (50). Poznanie czynników i sposobów regulacji ekspresji MnSOD i innych izoform dysmutazy ponadtlenkowej, może zwiększyć możliwości diagnozowania i leczenia nowotworów.

W chorobie nowotworowej istnieją wyraźne różnice między aktywnością SOD w zdrowych i zmienionych nowotworowo komórkach organizmu. Niska aktywność SOD jest charakterystyczna dla komórek niezróżnicowanych i nowotworowych. W przypadku komórek nowotworowych, które ulegną różnicowaniu aktywność tego enzymu wzrasta. Bardzo często obserwuje się zmiany aktywności SOD w tkankach odległych od miejsca wystąpienia nowotworu (49).

Obniżenie aktywności SOD zarówno Cu-ZnSOD jak i MnSOD występuje w różnych stadiach procesu nowotworowego w porównaniu do aktywności w zdrowych komórkach. Nie jest to jednak cecha charakterystyczna dla wszystkich typów nowotworów (64).

Badania aktywności SOD w układach in vitro wykazały że komórki, które uległy transformacji nowotworowej mają inny poziom aktywności SOD niż komórki normalne. W komórkach WI38 stransformowanych wirusem SV40 nie wykazano aktywności MnSOD, natomiast całkowita aktywność SOD była wyższa niż w normalnych komórkach WI-38 (60). Podobne wyniki uzyskano dla transformowanych SV40 komórek wątrobowych myszy (70). W intensywnie dzielących się komórkach wątrobiaka H6, stwierdzono niską aktywność CuZnSOD i nie wykazano aktywności MnSOD (57). W mitochondriach izolowanych z wątrobiaka Morrisa 3924A, mimo wysokiego stężenia rodnika ponadtlenkowego i nadtlenku wykazano niską aktywność SOD, zwłaszcza MnSOD (17).

Badania in vivo również wskazują na różnice w aktywności SOD w zmienionych nowotworowo i zdrowych tkankach organizmu. Całkowita aktywność SOD w nowotworach wątroby była niższa niż w zdrowej tkance. W normalnej tkance wątroby przylegającej do guza pierwotnego również obserwowano obniżoną aktywność całkowitą SOD. Natomiast aktywność SOD w guzach przerzutowych wątroby była podobna do aktywności enzymu w zdrowej wątrobie (10, 45).

Badania aktywności SOD w różnych schorzeniach żołądka u ludzi (np. nieżyt, choroba wrzodowa) wykazały podwyższoną aktywność CuZnSOD (4, 21). Natomiast w przypadkach stwierdzonego raka żołądka całkowita aktywność SOD w komórkach nabłonkowych żołądka, zarówno zmienionych nowotworowo jak i prawidłowych była obniżona. Również we krwi pacjentów z wczesnymi rakami żołądka obserwowano zmniejszoną aktywność SOD (78). Często w rakach żołądka obserwowano podwyższenie ekspresji MnSOD i wykazano różnice w ekspresji MnSOD pomiędzy pierwotnym rakiem żołądka, a guzami przerzutowymi (38, 40, 49, 73). Ekspresja MnSOD w guzach przerzutowych z żołądka do węzłów chłonnych była zdecydowanie wyższa (49, 73).

W nowotworach jelita grubego stwierdzano zarówno zwiększoną jak i zmniejszoną aktywność enzymów CuZnSOD i MnSOD w porównaniu z normalnym nabłonkiem (5, 55), co może wynikać z zastosowania różnych metod oznaczania aktywności SOD (6).

Rozwój raka jelita grubego w sekwencji: „normalny nabłonek – gruczolak – rak – przerzut” jest związany ze wzrostem ekspresji MnSOD. Wykazano zwiększenie ilości MnSOD i jej wyższą aktywność w komórkach epitelialnych, w guzach jelita w porównaniu do aktywności i ilości MnSOD w normalnym nabłonku i gruczolakach (39). Wydaje się, że w rakach jelita grubego wzrost aktywności MnSOD następuje już w początkowej fazie rozwoju raka (39). Dalszy wzrost aktywności MnSOD w polipach wskazuje na proces złośliwienia (43). Zaobserwowano pozytywną korelację pomiędzy poziomem mRNA MnSOD, a inwazją naczyniową w guzach jelita grubego. Wyniki te sugerują, że nadekspresja mRNA MnSOD w guzach jelita grubego może być związana ze zwiększoną agresywnością guzów (39, 73). Potwierdzają to również badania Satomi i wsp. (67), które wykazały, że aktywność SOD w tkance rakowej jelita grubego wzrastała wraz z rozwojem poszczególnych stadiów i zmieniała się w zależności od stopnia zaawansowania rozwoju choroby (inwazja naczyniowa).

W licznych badaniach zaobserwowano, że istnieje rozbieżność pomiędzy aktywnością, a ilością białka SOD w komórkach nowotworowych jelita grubego (39, 54). Wskazuje to, że aktywność enzymatyczna i ekspresja białka SOD w jelicie nie są ze sobą skorelowane. Zatem oznaczanie wyłącznie aktywności SOD nie obrazuje prawdziwego poziomu ekspresji tego enzymu w komórce. Wydaje się, że synteza MnSOD podlega indukcji w stresie oksydacyjnym, natomiast ekspresja CuZnSOD jest regulowana przez inne czynniki (24, 33). Zwiększony poziom WRT w komórkach raka jelita grubego nasila ekspresję mRNA MnSOD w tych komórkach, w celu przywrócenia równowagi oksydant-antyoksydant (77). Kolejnym stadiom w rozwoju raka jelita grubego towarzyszy dalszy wzrost aktywności MnSOD. Można zatem uważać MnSOD za wskaźnik stopniowego złośliwienia komórek rakowych jelita, a jej aktywność może być markerem prognostycznym przeżywalności pacjentów (39).

Badania aktywności SOD w raku sutka i w niezmienionej nowotworowo tkance, wykazały podwyższenie aktywności całkowitej SOD i MnSOD i różnice w ich aktywności w nowotworach złośliwych i łagodnych raka sutka (42, 48). Wskazuje to na podwyższenie poziomu WRT w zmienionych nowotworowo komórkach sutka.

Wyższej aktywności SOD w raku sutka towarzyszyło często podwyższenie aktywności innych enzymów antyoksydacyjnych (CAT, GPx), co wydaje się być związane z odpowiedzią komórek nowotworowych na stres oksydacyjny (42, 66).

Zwiększenie aktywności SOD obserwowano w rakach łagodnych i złośliwych jajników, w porównaniu ze zdrową tkanką (18). Aktywność MnSOD u pacjentek w różnych stadiach rozwoju raka jajników wzrastała wraz z kolejnymi stadiami rozwoju raka, co wskazywałoby na wysoką ekspresję genu MnSOD (56, 72). Wydaje się, że aktywność MnSOD może być użytecznym markerem diagnozowania i monitorowania raka jajników (72).

Natomiast w przypadku tkanki nowotworowej płuc stwierdzono obniżenie aktywności SOD (30). Bardzo często obserwowano duże zróżnicowanie osobnicze aktywności MnSOD w nowotworach płuc, szczególnie gruczoloakoraków (37). Immunohistochemiczna analiza innych enzymów antyoksydacyjnych (CAT, GPx, GSt) w nowotworach płuc również ujawniła ich niski poziom w komórkach nowotworowych w porównaniu z normalnymi komórkami (14). Niższą aktywność SOD wykazano również w erytrocytach pacjentów z rakiem płuc w porównaniu z aktywnością tego enzymu u zdrowych dawców krwi. Najniższa aktywność SOD w erytrocytach była obserwowana w III stadium raka płuc (22, 52).

U chorych na złośliwego czerniaka, w różnych stadiach choroby nie zaobserwowano w surowicy istotnych różnic w aktywności Cu-ZnSOD w porównaniu z kontrolą (surowica osób zdrowych). Były jednak obserwowane przypadki obniżonej aktywności całkowitej SOD w surowicy chorych z czerniakiem niezależnie od rozpoznanego stadium klinicznego. Stwierdzono, że komórki czerniaka pochodzące z przerzutów mają znacznie obniżoną aktywność MnSOD, a zanik aktywności MnSOD obserwuje się dopiero w zaawansowanych stadiach (68).

Również w przypadku stwierdzonej neuroblastomy obserwowano wyraźnie obniżoną aktywność obu form SOD (58).

Wysoką aktywność SOD stwierdzono w ludzkich komórkach białaczki (80). Natomiast aktywność SOD była obniżona w erytrocytach i surowicy krwi zarówno ludzi dorosłych jak i dzieci ze złośliwą białaczką, białaczką limfatyczną i chłoniakiem Hodgkinsa (1). Z kolei badania krwi dzieci zdrowych i z różnymi typami nowotworów (mózgu, szpiku, wątroby) nie wykazały różnic w aktywności SOD (65).

W nowotworach pierwotnych gruczołu krokowego i przerzutach do innych tkanek aktywność SOD była wyższa w porównaniu do zdrowej tkanki. Zdecydowanie jednak wyższą aktywność SOD obserwowano w przerzutach, co można tłumaczyć większą ilością wytwarzanych wolnych rodników (19, 62).

Obniżenie aktywności całkowitej SOD oraz obniżenie aktywności MnSOD lub jej brak, połączone z podwyższeniem ilości rodników ponadtlenkowych wydaje się być charakterystyczne dla większości komórek nowotworowych we wczesnym stadium rozwoju procesu nowotworowego (70).

Jeśli chodzi o aktywność dysmutazy cytozolowej to wyniki licznych badań wskazują, że obniżenie aktywności Cu-ZnSOD jest dość powszechne dla wielu typów nowotworów. Nie wydaje się być to jednak uniwersalną cechą charakterystyczną dla każdej komórki nowotworowej.

Wielu autorów uważa, że brak aktywności formy MnSOD jest charakterystyczny dla komórek stransformowanych i komórek nowotworowych in vitro i in vivo (17, 57, 80). Prowadzi to, do gromadzenia się dużych ilości rodnika ponadtlenkowego, powstawania uszkodzeń komórek i rozregulowania kontroli proliferacji komórek.

Na podkreślenie zasługuje fakt, że aktywność SOD w ludzkich komórkach normalnych jak i nowotworowych wykazuje znaczne różnice osobnicze. Zmiany aktywności tego enzymu zależą nie tylko od typu nowotworu, ale nawet od stadium jego rozwoju. Przypuszcza się, że obniżenie aktywności MnSOD może być związane z uszkodzeniami prowadzącymi do delecji w długim ramieniu chromosomu 6, gdzie znajduje się gen kodujący ten enzym. Mutacja tego typu jest bardzo często obserwowana w wielu typach nowotworów (np. rak piersi, czerniak) (23).

Niesprawny i osłabiony system antyoksydacyjny w chorobie nowotworowej powoduje kumulację wolnych rodników, które mogą powodować i nasilać proces powstawania przerzutów.

Większość nowotworów przechodzi poprzez kolejne stadia rozwoju związane ze stopniowym złośliwieniem. Nowsze prace wykazały wzrost aktywności i ekspresji SOD (szczególnie MnSOD) zależny od stadium nowotworu (39, 67), a szczególnie gdy nowotwór staje się złośliwy i powstają przerzuty (62).

Ponieważ aktywność MnSOD w wielu typach nowotworów jest często niższa niż w normalnych tkankach (69) podjęto badania w celu wyjaśnienia tego zjawiska. Zastosowane techniki biologii molekularnej pozwoliły określić strukturę ludzkiego MnSOD na podstawie komplementarnego cDNA wyizolowanego z guza raka grubego (HT-29). Dojrzałe białko składa się ze 198 aminokwasów poprzedzonych 24-aminokwasową sekwencją liderową. Na podstawie analizy sekwencji DNA stwierdzono, że region MnSOD, który ulega translacji jest taki sam w nowotworach jak i w zdrowych tkankach, ale wykazuje różnice w regionach 5´ i 3´ nie ulegających translacji. Czas półtrwania mRNA MnSOD (ok.10 h) jest taki sam w tkankach zdrowych i nowotworowych. Natomiast ilość białka MnSOD jest niższa w tkankach nowotworowych. Obniżony poziom MnSOD w komórkach rakowych jest związany bardzo często z defektami w ekspresji genu (23, 69). Obniżenie aktywności SOD w komórkach nowotworowych może wynikać ze zmniejszonych ilości mRNA SOD. I dlatego przy zachowanej całkowitej aktywności SOD w komórkach nowotworowych stwierdza się jednak obniżenie aktywności MnSOD.

Obserwowany wzrost bądź spadek ekspresji genów SOD w zależności od stadium i typu nowotworu świadczy o różnorodnych czynnikach wpływających na regulację ekspresji genów SOD w rozwoju procesu nowotworowego.

Jednym z podstawowych elementów obrony komórek przed szkodliwym działaniem wolnych rodników tlenowych jest synteza specyficznych białek enzymatycznych (SOD, CAT, GPx i inne) o właściwościach przeciwutleniających. Białka te określane stresowymi charakteryzują się zwiększoną syntezą w warunkach stresu. Jednym z nich jest dysmutaza ponadtlenkowa, zwłaszcza mitochondrialna MnSOD, która bierze udział w unieczynnianiu rodnika ponadtlenkowego. Ma ona podobnie jak inne enzymy antyoksydacyjne charakter konstytutywny i jest syntetyzowana w normalnych komórkach nie poddawanych stresowi. Jej aktywność natomiast zdecydowanie wzrasta w czasie stresu oksydacyjnego.