W stanie eutyreozy D1 odpowiada za syntezę około 34% obwodowej T3, natomiast w stanie tyreotoksykozy jej udział wzrasta do 67% (i więcej) w zależności od stopnia zaawansowania choroby (16). Aktywność D1 specyficznie hamuje 6-n-propylotiouracyl (PTU); właściwość ta jest wykorzystywana do różnicowania aktywności D1 od pozostałych dejodynaz.

Gen kodujący D1 ( Dio1) w genomie ludzkim zlokalizowany jest w pozycji 1p32-33, składa się z 4 eksonów (17). Transkrypcja Dio1jest regulowana między innymi przez hormony tarczycy. W promotorze Dio1znajdują się dwa pozytywne TRE: klasycznyTRE-DR4 (18,19) oraz nietypowy TRE-DR10 (18), umożliwiające aktywację transkrypcji genu przez receptory TR, a także miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego Sp1 (19, 20).

Pierwotny transkrypt Dio1podlega procesowi różnicowego składania eksonów, w wyniku którego powstają warianty transkrypcyjne o różnej sekwencji, w tym pozbawione elementów kodujących rejon białka zawierający centrum aktywne (ryc. 4).

Ekspresja genu Dio1jest zaburzona w nowotworach. Poziom mRNA i aktywności D1 są obniżone w raku brodawkowatym tarczycy (21-24), w raku jasnokomórkowym nerki (25, 26), w guzach glejowych mózgu (27), podwyższony w gruczolaku pęcherzykowym i raku pęcherzykowym tarczycy (21), raku piersi (28). Badania na liniach komórkowych raka piersi MCF-7 i MDA-MB-231 sugerują, że podwyższona ekspresja D1 ( Dio1) może stanowić marker różnicowania w komórkach nowotworowych (29).

Pierwsze doniesienia dotyczące zaburzonej ekspresji D1 w ccRCC zostały opublikowane przez nasz zespół w 1991 r. (25). Stwierdzono wówczas, że aktywność D1 była znacząco obniżona w tkance nowotworowej w porównaniu ze stanowiącą kontrolę zdrową tkanką otaczającą guz. Obniżona aktywność D1 korelowała z obniżonym poziomem białka. Kolejne badania wykazały znaczne zróżnicowanie aktywności D1 oraz jej ekspresji na poziomie mRNA pomiędzy próbkami kontrolnymi pobranymi od różnych pacjentów. Różnice w poziomie mRNA były nawet 10-krotne. W tkankach nowotworo-wych zarówno aktywność enzymatyczna jak i ilość mRNA D1 były prawie niewykrywalne (30, 26). Jedną z przyczyn obniżonej ekspresji D1 w nowotworach nerki może być zaburzona aktywacja transkrypcji Dio1przez receptory TR. Zmutowane wersje TR sklonowane z tkanek ccRCC aktywowały promotor genu Dio1znacznie słabiej, niż dzikie typy tych (31).

Analiza wariantów transkrypcyjnych klonowanych z tkanek ccRCC oraz z tkanek nienowotworowych z przeciwległego bieguna nerki nowotworowej, jak również z próbek pobranych z nerek nienowotworowych (powypadkowych, kamiczych, ektopowych, marskich) wykazała istnienie wielu nieopisanych do tej pory wariantów transkrypcyjnych Dio1, w tym wariantów pozbawionych eksonu 2, zawierającego rejon kodujący centrum aktywne. Zidentyfikowano m.in. warianty zawierające wszystkie 4 eksony, eksony: 1, 2, 4, eksony: 1 i 4, a nawet wariant składający się tylko z eksonu 1. Dokładna analiza poziomu ekspresji transkryptów genu Dio1,wykonana za pomocą techniki PCR czasu rzeczywistego ( real-time PCR) wykazała dramatycznie obniżony poziom ekspresji wszystkich wariantów transkrypcyjnych (o około 90%) w tkankach nowotworowych w porównaniu z tkankami kontrolnymi (32). Zaburzony był również proces różnicowego składania eksonów. W tkankach nowotworowych stwierdzono istotny statystycznie spadek stosunku wariantów transkrypcyjnych zawierających rejon kodujący centrum aktywne białka i wariantów pozbawionych tego rejonu. Stwierdzono, że zaburzenia różnicowego składania eksonów D1 wynikają prawdopodobnie z nieprawidłowej ekspresji czynników splicingowych SF2/ASF i hnRNPA1 w ccRCC (Piekiełko-Witkowska A., wyniki niepublikowane).

Receptory jądrowe trijodotyroniny, TR, to średniej wielkości białka jądrowe (TRβ1- 461 aminokwasów; 53 kDa), kodowane przez geny zlokalizowane na chromosomach trzecim ( THRB - 3p24.2) i siedemnastym ( THRA - 17q23).

W procesie różnicowego składania pierwotnego transkryptu powstają po dwie główne izoformy każdego receptora – odpowiednio TRα1 i TRα2 oraz TRβ1 i TRβ2. Receptory jądrowe T3 wpływają na ekspresję genów docelowych poprzez selektywne wiązanie się z promotorowymi sekwencjami DNA typu HRE ( Hormone Response Element), wzmacniając tym samym (lub osłabiając) wydajność transkrypcji. TR, podobnie jak inne białka z rodziny receptorów jądrowych, wykazują obecność dobrze scharakteryzowanych domen funkcjonalnych (ryc. 5). Wiązanie hormonu powoduje zmiany konformacyjne białka powodując zmiany w oddziaływaniu TR z koaktywatorami i korepresorami.

W pracy dotyczącej ekspresji TR w raku jasnokomórkowym nerki (33) stwierdzono, że ilość mRNA TRα1 była znamiennie zmniejszona w większości przypadków ccRCC w porównaniu z odpowiadającymi im tkankami kontrolnymi, natomiast ekspresja TRβ1 na poziomie mRNA była bardziej heterogenna: w 70% raków była znacząco zmniejszona, zaś w 30% – zwiększona w guzach w porównaniu z odpowiadającymi im kontrolami. Średnia ilość białka TRα1 była wyższa w ccRCC w porównaniu z tkankami kontrolnymi, podczas, gdy średnia ekspresja TRβ1 na poziomie białka była obniżona w tkankach tych samych nowotworów. Zwiększenie ilości TR niekoniecznie przekładało się na zwiększenie aktywności genów docelowych trijodotyroniny, ponieważ funkcja TR może być, i zwykle jest, zaburzona wskutek różnych mechanizmów, na przykład mutacji w genach kodujących TR, albo, prawdopodobnie, zaburzeń w modyfikacjach potranslacyjnych białka. W ccRCC znaleziono mutacje w receptorze trijodotyroniny (34). Mutacje dotyczyły obu izoform TRα1 i TRβ1; większość z nich znajdowała się w domenie wiążącej ligand, kilka zaś w domenie wiążącej DNA. Ponadto, odsetek tkanek ccRCC, w których stwierdzono mutacje TR wzrastał wraz ze spadkiem zróżnicowania histologicznego nowotworu (34). Badania funkcjonalne in vitro mutantów TR wykazały, że w zależności od miejsca, gdzie doszło do zmiany aminokwasu, mutanty takie nieprawidłowo wiążą T3 lub/i DNA oraz w sposób niedostateczny aktywują geny docelowe (34-38).

Składanie pre-mRNA ( splicing) THRB (ryc. 5B) polega na usuwaniu z pierwotnego transkryptu preRNA sekwencji niekodujących (intronów) i łączeniu pozostałych eksonów w gotowy do translacji mRNA. W wyniku alternatywnego składania mogą powstawać kodowane przez ten sam gen białka, różniące się od siebie sekwencją aminokwasów i funkcją, jak również białka identyczne, chociaż kodowane przez mRNA różniące się sekwencją UTR ( UnTranslated Region). UTR to część mRNA nie ulegająca translacji, położona w kierunku 5´ (5´-UTR) lub 3´ (3´-UTR) od sekwencji kodującej. Procesowi składania pre-mRNA podlegają również wspomniane obszary mRNA (5´- oraz 3´-UTR), których funkcja w dojrzałym mRNA polega na regulacji ekspresji genu na poziomie pre-translacyjnym. Najnowsze badania wskazują, że poziom translacji wariantów TR może być regulowany przez takie rejony mRNA (39). Innymi słowy, ilość powstającego białka TR jest zależna od wariantu splicingowego regionu 5´UTR mRNA. Obszary mRNA nie ulegające translacji mogą wpływać na trwałość cząsteczki RNA jak również inicjację oraz efektywność przebiegu samej translacji przez oddziaływanie obszarów 5´UTR na sekwencję kodującą, na tworzenie struktur II-rzędowych utrudniających inicjację translacji (40-41) jak również poprzez wiązanie małych cząsteczek regulatorowych miRNA do sekwencji 3´UTR, obniżających najczęściej efektywność procesu translacji (42-46). W ostatnim czasie wskazuje się na rolę miRNA oraz sekwencji 3´UTR w patogenezie nowotworów (46-48). Sekwencje mRNA nie ulegające translacji stanowią część znaczącego mechanizmu regulacji ekspresji genów na poziomie pre-translacyjnym.

Badania miały na celu określenie struktury i funkcji produktów różnicowego składania niekodujących sekwencji UTR pierwotnego transkryptu receptora TRβ1 w aspekcie jego ekspresji w prawidłowych i nowotworowo zmienionych komórkach. Analizowano ekspresję alternatywnie składanych form transkryptu izoformy receptora jądrowego trijodotyroniny TRβ1 w obrębie sekwencji nie ulegających translacji 5´-UTR. Ustalenie profilu form 5´-UTR wykonano w oparciu o łańcuchową reakcję polimerazy, z wykorzystaniem par starterów flankujących sekwencję niekodującą 5´UTR (w kierunku „forward”): ekson 1a,1b,1c lub 2a i sekwencję kodującą (w kierunku „reverse”): ekson 4 (początek ramki odczytu) lub ekson 10 (koniec ramki odczytu). Analizie jakościowej poddano pary kontrola-ccRCC, ustalone linie komórkowe różnego pochodzenia. Caki-2 (ccRCC), Caki-1 (przerzut skórny ccRCC), HK2 (kanaliki proksymalne nerki ludzkiej), HEK 293 (ludzkie komórki embrionalne nerki), MCF-7 (rak piersi), Jurkat cell line (ludzkie komórki limfoblastyczne T), Raji cell line (chłoniak B-komórkowy) jak również prawidłowe komórki nabłonka jamy ustnej oraz prawidłowe komórki jądrzaste krwi.

Analiza profili form 5´-UTR THRB wykazała, że: ekspresja alternatywnie składanych form splicingowych sekwencji 5´UTR THRB jest zależna od rodzaju tkanki i zaburzona w ccRCC. Prowadzi to do powstania różnych profili 5´UTR w ccRCC i kontrolach. Analiza profili 5´UTR wykazała zaburzenia alternatywnego splicingu nie tylko w ccRCC, ale również w ich kontrolach z przeciwległego bieguna nerki (różne profile eksonów 1a, 1b, 1c 5´UTR między kontrolami), co można próbować tłumaczyć parakrynnym i endokrynnym oddziaływaniem komórek ccRCC na tkankę otaczającą guz.

Analiza porównawcza profili wykazała, że w przeciwieństwie do wszystkich badanych eksonów THRB (1a, 1b, 1c), ekson 2a charakteryzuje się wysoką stabilnością profilu (układu prążków) nie tylko między różnymi tkankami, ale również między ccRCC oraz ich kontrolami, sugerując duże znaczenie tego eksonu dla ekspresji białka, jak również stabilność systemu różnicowego składania pierwotnego transkryptu dla eksonu 2 genu THRB.