Sygnał regulujący szlaki metaboliczne w komórkach tarczycy dochodzi poprzez receptor tyreotropiny (TSHR) po związaniu hormonu tyreotropiny (TSH), fizjologicznego stymulatora tarczycy. Poziom TSH w surowicy oznacza się przy użyciu bardzo czułych testów immunochemicznych, różnicujących normę (1-18 pmol/L, 0,3-5 mU/L) od niższych poziomów w nadczynności i wyższych w niedoczynności tarczycy. Metodą, która pozwala na określenie aktywności biologicznej TSH, a także innych aktywatorów jest pomiar ich wpływu na aktywność cyklazy adenylanowej w prezentujących receptor TSH komórkach ssaków. Najczęściej do tego pomiaru wykorzystywane są komórki jajowe chomika chińskiego (CHO) (1,2) z wbudowanym genem kodującym receptor. Rzadziej, aktywność biologiczną mierzono przez pomiar cyklazy adenylanowej w izolowanych komórkach tarczycy świni (3). Wykonanie obu powyższych oznaczeń wymaga wyspecjalizowanych laboratoriów, tak więc w sposób rutynowy nie bada się aktywacji komórek tarczycy przez TSH.

U chorych z chorobą Gravesa-Base-dowa występują autoprzeciwciała, któ-re są patologicznymi stymulatorami tar-czycy, a stymulacja jest skutkiem połą-czenia się autoprzeciwciała z recepto-rem TSH. Autoprzeciwciała stymulujące (TSAb) są oligoklonalne, a więc wytwarzane przez kilka klonów limfocytów B, należą do podklasy IgG1 (4) i występują w surowicy w bardzo małych ilościach (5) co wskazuje, że zostały wytworzone we wczesnych okresach procesu autoimmunizacyjnego. U chorych występują też autoprzeciwciała, które wiążą się z receptorem ale go nie aktywują, natomiast uniemożliwiają związanie TSH. Są to autoprzeciwciała blokujące (TBAb), powodujące niedoczynność w chorobie Hashimoto. Te autoprzeciwciała są poliklonalne (6,7). W surowicy konkretnego chorego mogą występować zarówno autoprzeciwciała stymulujące jak i blokujące, a także neutralne, nie posiadające aktywności biologicznej.

Poziom autoprzeciwciał w surowicach chorych wyznacza się na podstawie siły z jaką hamują wiązanie znakowanego TSH do receptora. Dostępne komercyjnie testy są oparte na tej zasadzie i nie pozwalają na rozróżnienie autoprzeciwciał stymulujących od blokujących (8). Być może będą one zmodyfikowane przez zastąpienie znakowanego TSH przeciwciałem monoklonalnym (9), co w dalszym ciągu nie pozwoli jednak na rozróżnienie aktywności auto-przeciwciał. To rozróżnienie może dać zbadanie wpływu autoprzeciwciał na aktywność cyklazy adenylanowej w komórkach prezentujących receptor: wzrost poziomu cAMP wskaże na obecność przeciwciał stymulujących, natomiast brak zmian poziomu cAMP w obecności przeciwciał i TSH wskaże na obecność przeciwciał blokujących (10). Najnowsze podejście do badania przeciwciał antyreceptorowych przedstawia praca poglądowa prof. Bernarda Rees Smith i wsp. opublikowana w Thyroid (11).

Niskie stężenie autoprzeciwciał u chorych bardzo utrudnia dokładniejsze poznanie epitopów na cząsteczce re-ceptora rozpoznawanych przez te autoprzeciwciała i dokładniejsze zbadanie interakcji autoprzeciwciał z receptorem. W tym celu pomocne są przeciwciała monoklonalne. W wyniku immunizacji myszy różnymi preparatami błonowymi otrzymano cały szereg przeciwciał monoklonalnych. Wszystkie przeciwciała otrzymywane w początkowym okresie, do roku 1996 blokowały receptor. Dopiero zastosowanie do immunizacji zmodyfikowanych fibroblastów prezentujących zarówno TSHR jak i antygeny zgodności tkankowej klasy II, (12) pozwoliło na uzyskanie przeciwciał stymulujących. Następne przeciwciała stymulujące o wysokim powinowactwie i mianie uzyskano w kilku pracowniach przy zastosowaniu immunizacji genowej (13-16)

Największy postęp w tłumaczeniu procesu wiązania się autoprzeciwciał z receptorem przyniosły wyniki badań ludzkich przeciwciał monoklonalnych. W 2003 otrzymano ludzkie przeciwciało monoklonalne (M22) o aktywności stymulującej (17). Przeciwciało to pochodziło z namnożonych przy użyciu wirusa Epstein Barr limfocytów krwi obwodowej pacjenta z chorobą Gravesa-Basedowa. Techniką immunoenzymatyczną (ELISA) stwierdzono konkurencję M22 i autoprzeciwciał pacjentów w wiązaniu z receptorem TSH, przy czym dotyczyło to zarówno autoprzeciwciał o aktywności stymulującej jak i hamującej. Autoprzeciwciała od ponad 100 chorych hamowały wiązanie M22 z siłą, która korelowała z ich aktywnością w hamowaniu wiązania TSH, co sugerowało bliską relację rejonów receptora oddziałujących z autoprzeciwciałami, z M22 i z TSH. Wykonanie oznaczeń z dobrze scharakteryzowanym ludzkim monoklonalym przeciwciałem stymulującym, jakim jest M22 pozwoliło wyznaczyć stężenia autoprzeciwciał stymulujących u chorych na 50-500 ng/ml (0,33-3,3 nmol/L). Stężenie to jest porównywalne do stężenia TSH powodującego nadczynność tarczycy podobną do nadczynności chorych na chorobę Gravesa-Basedowa (18).

Ostatnio otrzymano również ludzkie przeciwciało monoklonalne o aktyw-ności blokera (5C9) (19). Hamowało ono zarówno wiązanie jak i stymulację komórek przez TSH, przez M22, przez surowice pacjentów i przez mysie antyreceptorowe przeciwciała monoklonalne. Tak jak w przypadku M22 konkurencja dotyczyła zarówno przeciwciał o aktywności stymulującej jak i blokującej. Wyniki te sugerowały podobieństwo epitopów rozpoznawanych przez różne autoprzeciwciała. W rzeczywistości jednak autoprzeciwciała od poszczególnych chorych cechuje znaczna zmienność. Na istnienie różnic, ale też i podobieństw, w epitopach wskazują między innymi wyniki doświadczeń z mutacjami. Po wprowadzeniu punktowych mutacji do cząsteczki TSHR aktywność stymulująca autoprzeciwciał pacjentów zmienia się w różny sposób. Ze zbadanych mutacji wyjątkiem była mutacja reszty R255 w receptorze, która uniemożliwiała wiązanie autoprzeciwciał stymulujących wszystkich chorych, nie wpływając na wiązanie TSH ani na wiązanie autoprzeciwciał blokujących. Tak więc do terapii pacjentów, u których nadczynność jest spowodowana obecnością autoprzeciwciał stymulujących należałoby wprowadzić czynnik specyficznie blokujący tą resztę (11).

Błonowy receptor TSH należy do dużej grupy receptorów współdziałających z regulatorowym białkiem G. Bardzo szczegółowy model TSHR opracowany z zastosowaniem najnowszych programów komputerowych zaproponowali Miguel i wsp. (ryc. 1A) (3). Model ten w znacznej mierze pokrywa się z wcześniejszymi modelami opartymi na analogiach budowy kolejnych części cząsteczki receptora z budową związków które zostały wykrystalizowane i których struktura została wyznaczona na podstawie dyfrakcji promieni X. Z 744 reszt aminokwasów budujących receptor, 397 reszt stanowi część pozakomórkową a pozostałe część transbłonową i cytoplazmatyczną receptora. W części pozakomórkowej wyróżnić można fragment N-końcowy, bogaty w cysteiny, który ma strukturę podobną do występującej w naskórkowym czynniku wzrostu (20), fragment bogaty w leucyny (LRD, reszty 58-277), którego struktura została zaproponowana na podstawie struktury inhibitora rybonukleazy (21), i fragment „zawiasowy”. Dwa pierwsze z tych fragmentów i część fragmentu „zawiasowego” tworzy podjednostkę A receptora. Mniej wiadomo o strukturze a również i o funkcji fragmentu „zawiasowego”. W wyniku posttranslacyjnego dojrzewania receptora część tego fragmentu obejmująca reszty aminokwasowe 313-371, nazwana Peptydem C uwalniana jest z receptora, w wyniku czego receptor przyjmuje formę dimeru (22).Ta modyfikacja nie obniża wiązania TSH i autoprzeciwciał przez receptor. Receptor zarówno w formie monomeru jak i dimeru stabilizowany jest przez mostki dwusiarczkowe 241-390 i 301-408. Ich redukcja powoduje uwolnienie podjednostki A receptora. Wykazano, że wolna podjednostka A wiąże autoprzeciwciała silniej niż cały receptor (23). Fragment pozakomórkowej części receptora przylegający do błony cechuje obecność jednej struktury beta i jednej helisy alfa.

Dla części transbłonowej receptora przyjęto strukturę rodopsyny w której 21% sekwencji aminokwasów jest identycznych do sekwencji występujących w TSHR. Cechą charakterystyczną tej części jest obecność siedmiu, przechodzących przez błony alfa helis oraz łączących je pętli pozabłonowych i cytoplazmatycznych, podobnie jak w innych receptorach współdziałających z regulatorowym białkiem G. Krótka część cytoplazmatyczna receptora jest zaproponowana również na podstawie budowy rodopsyny. Część transbłonowa i cytoplazmatyczna receptora łącznie z krótkim fragmentem pozakomórkowym (do aminokwasu 370) stanowi podjednostkę B receptora. Na tym modelu receptora autorzy umieścili cząsteczkę TSH (3). Przy tworzeniu modelu kompleksu TSH-TSHR uwzględniono uprzednio uzyskane dane eksperymentalne takie jak: udział reszt 246--260, 277-296 i 381-385 w wiązaniu TSH i w wiązaniu autoprzeciwciał, mutacje Ser 281 i mutacje aminokwasów domeny transbłonowej prowadzące do wzrostu aktywności podstawowej cyklazy adenylanowej, różnice w wiązaniu z receptorem cząsteczek ludzkiego TSH (hTSH) oraz TSH ze świń i z wołów oraz dane dotyczące wiązania gonadotropiny kosmówkowej (hCG). Opracowany model uwidocznił bezpośredni kontakt lub utworzenie wiązania wodorowego pomiędzy aż 74 konkretnymi resztami aminokwasowymi domeny LRD i dodatkowo 14 resztami z fragmentu „zawiasowego” receptora z odpowiednimi resztami w cząsteczce hTSH. Ponadto uwidocznił występowanie 15 aminokwasów obdarzonych ładunkiem w na tyle bliskim sąsiedztwie TSH, że może dojść do utworzenia wiązań jonowych.

Nieco inny model kompleksu TSH-TSHR uwzględniający podobieństwa i różnice w wiązaniu hormonów glikoproteinowych TSH, LH, FSH i hCG z odpowiednimi receptorami oraz dane dotyczące wiązania tych hormonów z receptorami o mieszanej budowie (chimerycznymi) zaproponowali Moyle i wsp. (24). Model uwzględniał obecność szeregu reszt o ładunku dodatnim bliżej końca karboksylowego domeny LRD, które oddziałują z konserwatywną resztą asparaginy w hormonach. W modelu tym zwrócono uwagę na zmiany, które zachodzą po dołączeniu TSH; związanie hormonu zwiększa przestrzeń pomiędzy aminowym końcem części zawiasowej i domeną LRD oraz powoduje przesunięcie tej domeny w stosunku do domeny TMB i to pozwala na przeniesienie sygnału.

Każdy z powyższych modeli wskazuje nieco inne ułożenie cząsteczki TSH w stosunku do receptora, natomiast oba modele, zgodnie z wcześniejszymi wskazują na domenę LRD jako podstawę do wytworzenia kompleksu.