Główną fizjologiczną funkcją tarczycy jest produkcja hormonów T3 i T4. Pierwszym etapem biosyntezy hormonów tarczycy jest transport jonów jodkowych (I^-) z krwioobiegu do koloidu. Transport I^- w tarczycy przebiega w dwóch etapach i jest katalizowany przez NIS i pendrynę, białka zlokalizowane na przeciwnych biegunach tyreocyta. Symporter sodowo-jodowy (NIS) zlokalizowany jest w błonie podstawnej tyreocyta. Jego fizjologiczna rola polega na katalizowaniu aktywnego, sodowo-zależnego transportu jodków z krwi do wnętrza komórki tarczycy. Gen kodujący NIS znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 19 w pozycji 13 (19p13) i składa się z 15 egzonów oraz 14 intronów (1). Koduje białko zbudowane z 643 aminokwasów o masie molekularnej wynoszącej około 70-95 kDa. W strukturze przestrzennej tego białka występuje 13 trans-membranowych fragmentów. NIS należy do rodziny białek transportujących aniony SLC5A (ang. solute carrier family 5). Białka z tej rodziny wykazują wysoką homologię pomiędzy sobą i charakteryzują się zbliżoną funkcją. Wykorzystują elektrochemiczny gradient sodu, jako siłę napędową do transportu swoistej dla nich substancji (2, 3). Nagromadzone wewnątrz komórki jony I^- są następnie transportowane przez błonę szczytową do światła koloidu. Uważa się, że jednym z białek odpowiedzialnych za ten transport jest pendryna. Pendryna należy do rodziny białek transportujących aniony zwanej SLC26 (ang. solute carrier family 26). Białka z tej rodziny charakteryzuje duża jednorodność struktury przestrzennej. Ich podstawową funkcją jest transport jonów organicznych i nieorganicznych, a proces ten jest niezależny od gradientu jonów sodowych (4). Pendryna jest silnie hydrofobową błonową glikoproteiną o masie cząsteczkowej ok. 115 kDa składającą się z 780 reszt aminokwasowych. Podobnie jak inne białka należące do rodziny transporterów SLC26 składa się z 12 dużych fragmentów przezbłonowych połączonych krótkimi pętlami ułożonymi naprzemiennie wewnątrz i zewnątrz cytoplazmatycznie. Fragmenty N- i C- końcowe białka zlokalizowane są wewnątrz komórki (5). Gen kodujący pendrynę oznaczony skrótem PDS (SLC26A4 ang. Pendred syndrome gene) sklonowano w 1997 roku (6). U ludzi gen PDS zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 7 w pozycji 31, w pobliżu genu DRA// CLT (SLC26A3) (7). Mutacje w obrębie genu PDS są odpowiedzialne za występowanie zespołu Pendreda, schorzenia charakteryzującego się wrodzoną głuchotą, częściowym defektem organifikacji jodków oraz wolem (8, 9).

Podczas transformacji nowotworowej w komórkach tarczycy obserwuje się nieprawidłowości w wewnątrzkomórkowym metabolizmie jonów jodkowych (10, 11). Wiążą się one ze zmianami lub brakiem ekspresji kluczowych białek zaangażowanych w proces biosyntezy hormonów takich, jak: TPO, Tg, NIS oraz pendryny (12,13).

W prezentowanej pracy badano poziom ekspresji NIS i pendryny w dużej grupie próbek pochodzących od pacjentów ze zróżnicowanymi rakami tarczycy w odniesieniu do tkanek prawidłowych pochodzących od tych samych pacjentów.

Tkanki tarczycy otrzymano z Centrum Onkologii Instytutu im. Marii Skłodowskiej-Curie w Gliwicach. Do analizy metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (real-time) użyto 74 tkanek tarczycy pochodzących od 43 pacjentów (32 kobiet i 11 mężczyzn w wieku od 15 do 74 lat, średnia wieku 46 lat). Analizie poddano 31 tkanek prawidłowych i 43 zróżnicowane raki tarczycy z których ponad połowa (56%) była o średnicy>1 cm do ≤ 4 cm -T2. Wszystkie otrzymane pooperacyjnie skrawki tarczyc przechowywano w temperaturze -80°C.

Poziom ekspresji genu PDS w tkankach tarczycy analizowano metodą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym (real-time RT-PCR).

Do izolacji RNA wykorzystywano zestaw RNeasy Mini Kit (Qiagen). Całkowite RNA izolowano z około 100 mg tkanki zgodnie z załączoną przez producenta instrukcją.

Pomiarów stężenia otrzymanego RNA dokonywano metodą spektrofotometryczną przy długości fali 260 nm w odniesieniu do długości fali 280 nm. Stosunek pomiaru stężenia przy długości fal: A₂₆₀/A₂₈₀ określał czystość preparatu i w większości badanych prób wynosił od 1.7-2.0. Próby, w których wartość współczynnika nie mieściła się w wymienionym zakresie odrzucano, a RNA ponownie izolowano.

Do syntezy cDNA wykorzystywano zestaw Superscript II RT (GIBCO-BRL). W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły: heksamery o przypadkowej sekwencji (1μg), całościowe RNA (1μg), mieszanina trójfosforanów deoksyrybonukleotydów (dATP, dTTP, DTP, dGTP) o stężeniu końcowym 200μM, inhibitor RNazy (1μl), 1x stężony bufor dla polimerazy oraz 200 jednostek odwrotnej transkryptazy (Invitrogen).

Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono w objętości 20 μl w temperaturze 37°C przez 1 godzinę, a następnie przez 10 minut w temperaturze 70°C. Otrzymane cDNA przechowywano w -20°C.

Ilościowe oznaczenie poziomu mRNA dla NIS i pendryny oraz genu referencyjnego β-aktyny wykonano przy użyciu zestawu firmy PE Applied Biosystems.

Reakcję QRT-PCR prowadzono w aparacie GeneAmp 5700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) na 96 dołkowych płytkach w objętości 25 μl. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły: gotowy zestaw starterów i sond dla genów NIS i PDS oraz referencyjnego genu β-aktyny (TaqMan Assays-on-demand gene expression, PE Applied Biosystems, PDS - Id: Hs00166504_ml i β-aktyna - Id: Hs99999903_ml), 1μg cDNA, TaqMan Universal PCR Master Mix 25 μl. Po wstępnej 10 minutowej denaturacji w temperaturze 95°C reakcję amplifikacji przeprowadzono w następujących warunkach:

l 30 cykli składających się z następujących etapów:

– denaturacja (w temp. 95°C przez 15 sek.),

– przyłączanie starterów i wydłużanie (w temp. 60°C przez 1 min.).

l 1 cykl składający się z końcowego wydłużania w temperaturze 72°C przez 10 minut.

Otrzymane wyniki ekspresji genu NIS i PDS normalizowano względem genu referencyjnego β-aktyny. W tym celu poziom ekspresji genu PDS określano z krzywej standardowej i dzielono przez poziom ekspresji genu β-aktyny. Do skonstruowania krzywej standardowej dla obu genów użyto cDNA z puli sześciu tkanek prawidłowych tarczycy w czterech różnych rozcieńczeniach cDNA: 200 ng, 50 ng, 12,5 ng, 3,125 ng. Dla każdej badanej próby wykonywano dwa powtórzenia, które uśredniano.

Wyniki analizowano używając aplikacji Q-Gene do Microsoft Excel(r).

Poziom ekspresji białka i jego lokalizację komórkową badano metodą immunohistochemiczną. Materiał stanowiły zaparafinowane archiwalne bloczki tkanek tarczycy. Reakcję immunochistochemiczą z przeciwciałami antyNIS i antypendryna przeprowadzono zgodnie z uprzednio opisaną procedurą (14, 16).

W opracowaniu statystycznym wyników stosowano test Whitneya-Manna, nieparametryczną korelację Spearmana. Istotność różnic na poziomie 5% (P ≤ 0,05) uznana była za istotną, a na poziomie 0,1% (P ≤ 0,001) za wysoce istotną.

Poziom ekspresji genu NIS i PDS w tkankach tarczycy badano metodą ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym.

We wszystkich 31 analizowanych tarczycach prawidłowych oraz 43 zróżnicowanych rakach tarczycy wykryto transkrypt genów NIS i PDS. Obserwowany poziom ekspresji obu genów był heterogenny zarówno w analizowanych tkankach prawidłowych jak i w zróżnicowanych rakach tarczycy (ryc. 1). W części raków poziom mRNA NIS (14/33%) i PDS (2/5%) był bardzo niski (na granicy czułości metody).

W zróżnicowanych rakach tarczycy w zależności od wartości względnego poziomu ekspresji genu NIS wyróżniono trzy grupy tkanek. Do pierwszej grupy zaliczono 22 (51%) przypadki o poziomie ekspresji obserwowanej dla tkanek prawidłowych. Drugą grupę stanowiło 7 (16%) raków o obniżonej ekspresji w porównaniu do tkanek prawidłowych i ostatnią, trzecią grupę 14 (33%) tkanek o bardzo niskiej ekspresji genu NIS (tab.1). Zakres średniej znormalizowanej ekspresji (MNE) mRNA NIS w tarczycach prawidłowych wynosił od 0,02 do 3,8 a w rakach w od 0,0003 do 0,661 MNE. Średni poziom mRNA pendryny był wyższy w tkankach prawidłowych (3-krotnie) i w rakach (4-krotnie) od średniego poziomu mRNA dla NIS i wynosił w tarczycach prawidłowych od 0,08 do 8,06 a w rakach od 0,02 do 1,73.

Podobnie jak w przypadku genu NIS analiza poziomu mRNA PDS w rakach tarczycy pozwoliła na wyróżnienie trzech grup tkanek (tab. 2). Do pierwszej grupy zaliczono większość przypadków 30 (70 %) w drugiej grupie znalazło się 11 (25 %) raków, a tylko 2 (5 %) stanowiły trzecią grupę raków o bardzo niskiej ekspresji genu PDS (tab. 2).