Choroby autoimmunologiczne pole-gają na załamaniu tolerancji organizmu na autoantygeny i skierowaniu odpo-wiedzi immunologicznej przeciwko wła-snym tkankom i narządom. W zależności od lokalizacji procesu chorobowego mamy do czynienia z bardzo zróżnicowanymi zespołami objawów, zgrupo-wanymi w ponad 70 jednostek chorobowych (cukrzyca typu 1, autoimmunologiczne choroby tarczycy, stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, niedokrwistość hemolityczna, toczeń układowy i wiele innych). Wspólną cechą chorób autoimmunologicznych jest obecność w surowicy pacjentów autoprzeciwciał, które odgrywają znaczącą rolę w diagnostyce choroby, przy czym poziom tych przeciwciał często koreluje z zaawansowaniem stanu chorobowego (1).

Autoimmunologiczne choroby tarczy-cy (AITD – ang. autoimmune thyroid diseases) mogą być uznane za niezwykle istotny model choroby o podłożu autoimmunologicznym, zarówno ze względu na wysoką częstość występowania w populacji ludzkiej (2%), jak i na dostępność modeli zwierzęcych (2). Do tej grupy chorób zalicza się zapalenie tarczycy typu Hashimoto, prowadzące do niedoczynności tarczycy, oraz chorobę Gravesa-Basedowa, powodującą nadczynność tego gruczołu. W surowicach pacjentów z AITD oznaczane są autoprzeciwciała skierowane przeciwko białkom tarczycowym, a szczególnie przeciwko głównemu antygenowi mikrosomalnemu – peroksydazie tarczycowej (TPO) (3). Przeciwciała anty-TPO występują w surowicach ponad 90% pacjentów z chorobą Hashimoto i 75% pacjentów z chorobą Gravesa-Basedowa, są zatem ważnym mar-kerem diagnostycznym autoimmunologicznych chorób tarczycy (4).

Mimo wielu lat badań etiologia i patogeneza chorób autoimmunologicznych nie została w pełni poznana i wyjaśniona. Co ciekawe, liczba autoantygenów w porównaniu z liczbą wszystkich ludzkich białek jest bardzo mała – szacuje się, że autoantygeny stanowią nie więcej niż 1-2% ogólnej liczby białek (5). W ogromnej większości przypadków do tej pory nie wiadomo, dlaczego dane białko zostaje autoantygenem, choć proponuje się wpływ takich czynników, jak strukturalne właściwości samego białka (w tym obecność sekwencji homologicznych do sekwencji czynników infekcyjnych – tzw. mimikra molekularna), jego lokalizacja i katabolizm, a także właściwości immunologiczne/prozapalne (5). Istnieje wiele danych świadczących, że autoprzeciwciała w różnych jednostkach chorobowych wiążą się często z ograniczonym regionem na powierzchni autoantygenu – tzw. domeny czy regionu immunodominującego (6, 7, 8). Występowanie takich immunodominujących determinant antygenowych może być spowodowane mechanizmami immunologicznej regulacji oraz//lub konsekwencją cech strukturalnych autoantygenu. Dlatego też określenie struktury i lokalizacji autoepitopów (regionów autoantygenów rozpoznawanych przez autoprzeciwciała) może być bardzo istotne w zrozumieniu mechanizmów prowadzących do powstania i rozwoju choroby autoimmunologicznej (9).

Analiza struktur krystalicznych wielu kompleksów antygen-przeciwciało oraz ich niezwiązanych składowych wykazała, że podczas tworzenia kompleksu zachodzą konformacyjne zmiany zarówno przeciwciała, jak i wiązanego antygenu. A zatem przeciwciało rozpoznaje antygen raczej zgodnie z modelem „indukowanego dopasowania”, a nie modelem „klucza i zamka” (10). Dopasowanie oddziałujących powierzchni nie musi być doskonałe, wewnątrz znajdują się często cząsteczki wody, które mogą pośredniczyć w wiązaniu pomiędzy przeciwciałem a antygenem (11). Powierzchnie oddziaływań antygen-przeciwciało są względnie płaskie, okrągłe lub eliptyczne, zajmują średnio od 700 do 1700A², a w większości kontaktów pomiędzy przeciwciałem a antygenem uczestniczą łańcuchy boczne reszt aminokwasowych (12,13,14). W reakcji antygenu z przeciwciałem udział biorą wiązania jonowe (mostki solne), wiązania wodorowe i wiązania van der Waalsa (15). Silne mostki solne i ich duże usieciowanie prowadzą do większej specyficzności, ale mniejszej elastyczności oddziaływania. Odwrotnie, wiązania wodorowe i mała liczba wiązań jonowych związane są z elastycznością konformacyjną i mniejszą specyficznością interakcji antygen-przeciwciało. Dlatego mutacja reszty aminokwasowej obdarzonej ładunkiem wywołuje zazwyczaj znaczące efekty w reakcji przeciwciała z antygenem, natomiast mutacja reszty hydrofobowej jest najczęściej mniej poważna (16). Na podstawie składu chemicznego trudno jak dotąd zidentyfikować miejsca oddziaływań antygen-przeciwciało. Wiadomo, że w paratopie przeciwciała obserwuje się dużą częstość występowania aminokwasów aromatycznych (34% reszt amino-kwasowych wchodzących w kontakt z antygenem), natomiast w epitopie antygenu udział aminokwasów aromatycznych jako reszt kluczowych dla kontaktu z przeciwciałem jest niewielki (11).

Przeciwciała powstające w czasie od-powiedzi immunologicznej w 90% roz-poznają epitopy nieciągłe, konformacyjne (10). Epitopy takie są zbudowane z reszt aminokwasowych, które nie zawsze sąsiadują ze sobą w sekwencji liniowej (strukturze pierwszorzędowej) białka, ale są położone blisko siebie w strukturze trzeciorzędowej wskutek odpowiedniego sfałdowania łańcucha polipeptydowego. Epitopy nieciągłe mogą zawierać kilka ciągłych odcinków aminokwasowych i często zbudowane są z reszt aminokwasowych 2-5 oddzielnych regionów łańcucha polipeptydowego.

Zbiór wszystkich reszt aminokwasowych będących w kontakcie z resztami aminokwasowymi przeciwciała (odległość międzyatomowa mniejsza niż 4A°) jest nazywany epitopem strukturalnym (10). Składa się on zazwyczaj z 15-22 reszt aminokwasowych. Czy reszty te biorą udział w energii wiązania wyjaśnić można jedynie w badaniach funkcjonalnych, mierzących zmianę powinowactwa przeciwciała do antygenu spowodowaną podstawieniem pojedynczego aminokwasu. Badania takie wykazały, że tylko od 3 do 5 reszt aminokwasowych epitopu strukturalnego wnosi indywidualnie znaczący wkład w energię wiązania, tworząc tzw. epitop funkcjonalny (10). Aminokwasy epitopu funkcjonalnego antygenu odpowiadają za ok. 90% energii wiązania przeciwciała (17).

Ze względu na złożoną, nieciągłą budowę epitopów konformacyjnych, jedynie ustalenie struktury krystalicznej kompleksów antygen-przeciwciało może dać pełną informację o resztach aminokwasowych antygenu uczestniczących w wiązaniu przeciwciała. Oczyszczenie białek i otrzymanie kryształów wysokiej jakości, umożliwiających prawidłową analizę krystalograficzną, jest jednak często poważnym i niezwykle trudnym wyzwaniem. Dlatego stosowanych jest szereg innych technik mapowania epitopów konformacyjnych, które obejmują chemiczną modyfikację łańcuchów bocznych reszt aminokwasowych, badanie fragmentów antygenów chronionych przed modyfikacją lub proteolizą przez związanie przeciwciała, konstrukcję skróconych form antygenu i jego różnych fragmentów, konstrukcję wariantów hybrydowych pomiędzy antygenem a homologicznym białkiem, zastosowanie syntetycznych peptydów odpowiadających fragmentom sekwencji antygenu (17,18). W ostatnich latach niezwykle wartościowe w mapowaniu i definiowaniu epitopów konformacyjnych okazało się wprowadzenie metod ukierunkowanej mutagenezy (ang. site-directed mutagenesis) oraz testów prezentacji na fagu (ang. phage display).

Ukierunkowana mutageneza polega na podstawieniu wybranych reszt aminokwasowych, przy zastosowaniu technik rekombinowanego DNA, aminokwasami o innych właściwościach. Często stosowane jest podstawienie alaniną, niewielkim aminokwasem z grupą metylową, co pozwala na ustalenie udziału łańcuchów bocznych w energii wiązania. Natomiast podstawienie aminokwasami z łańcuchami bocznymi o większej objętości może umożliwić identyfikację innych reszt, które nie mają indywidualnie znaczącego udziału w energii wiązania (17).

W testach prezentacji na fagu do poszukiwania sekwencji, które wiążą badane przeciwciało z wysokim powinowactwem, stosuje się biblioteki przypadkowych peptydów w fuzji z białkami kapsydu bakteriofagów (19). Bakteriofagi „prezentują” sekwencje peptydowe na powierzchni, co umożliwia badanie oddziaływania tych sekwencji z przeciwciałami. Otrzymane peptydy (tzw. mimotopy) funkcjonalnie imitują epitopy konformacyjne, niekoniecznie posiadając tę samą sekwencję aminokwasową. Możliwe jest bowiem imitowanie nieciągłego epitopu poprzez rozmieszczenie w sekwencji liniowej kilku krytycznych aminokwasów w taki sposób, by ich łańcuchy boczne były ustawione podobnie jak w nieciągłym epitopie konformacyjnym. Do analizy mimotopów i znalezienia odpowiadających im sekwencji antygenu stosuje się zaawansowane metody komputerowe.

Ludzka peroksydaza tarczycowa (TPO), główny autoantygen w autoimmunologicznych chorobach tarczycy, należy do rodziny pero-ksydaz ssaczych, w skład której wchodzą również mieloperoksydaza, laktoperoksydaza, peroksydaza eozynofili oraz peroksydaza ślinowa. TPO jest głównym enzymem uczestniczącym w biosyntezie hormonów tarczycy. Enzym ten katalizuje utlenianie jodków w obecności H₂O₂ i jodowanie tyrozyn, które są następnie sprzęgane do trijodotyroniny (T3) i tetrajodotyroniny (T4) (20). Peroksydaza tarczycowa zawiera jako grupę prostetyczną kowalencyjnie związaną cząsteczkę hemu b. W komórce TPO jest zlokalizowana w błonie szczytowej, a duża część zewnątrzkomórkowa tego białka jest zwrócona w stronę światła pęcherzyka tarczycowego. Peroksydaza tarczycowa jest białkiem glikozylowanym, w swojej sekwencji posiada 4 potencjalne miejsca przyłączania reszt cukrowych. Postuluje się, że TPO w stanie natywnym może występować jako dimer o masie ok. 220 kD (21).

Ludzka peroksydaza tarczycowa zbudowana jest z 933 aminokwasów, które obejmują: region zewnątrzkomórkowy składający się z 846 aminokwasów (w tym 18-aminokwasowa sekwencja sygnałowa), domenę transbłonową (25 aminokwasów) oraz krótki odcinek cytoplazmatyczny (62 aminokwasy) (ryc. 1). W domenie zewnątrzkomórkowej (tzw. ektodomenie) można wyróżnić trzy obszary wykazujące wysoką homologię do sekwencji innych białek. Region 142-738 posiada 42% identyczności i 71% podobieństwa do sekwencji mieloperoksydazy (domena typu MPO), region 739-795 posiada 21% identyczności i 48% podobieństwa do sekwencji 15-tej domeny czynnika H dopełniacza (domena typu CCP), natomiast region 796-841 posiada 36% identyczności i 62% podobieństwa do sekwencji domeny epidermalnego czynnika wzrostu w fibrylinie (domena typu EGF) (22). Podczas posttranslacyjnego procesu dojrzewania peroksydazy N-końcowe reszty aminokwasowe 1-108 są usuwane z białka (23).