Siatkówczak (S) zajmuje szczególne miejsce pośród nowotworów – jest to pierwszy nowotwór o udowodnionej dziedzicznej etiologii, na którego przykładzie kształtowały się idee „dwu trafień” i genów supresorowych (1, 2, 3).

S pojawia się z częstością 1: 25 000 żywych urodzeń. Mimo swojej rzadkości S jest najczęstszym nowotworem wewnątrzgałkowym u dzieci a większość przypadków rozpoznawanych jest przed 5 r.ż. U dorosłych S jest wielką rzadkością. 60% przypadków S ma charakter sporadyczny w ścisłym znaczeniu tego słowa; są one wywołane mutacjami somatycznymi w komórkach siatkówki. Pozostałe 40% pacjentów to dzieci obciążone mutacjami konstytucyjnymi – wśród nich 10-15% to przypadki rodzinne a pozostałych 25-30% to przypadki rodowodowo sporadyczne, powstałe jednak w wyniku konstytucyjnej mutacji germinalnej de novo. Mutacja konstytucyjna ma penetrację sięgającą 90%. Do powstania nowotworu konieczne jest unieczynnienie białka pRB; które ma miejsce dopiero po utracie funkcji obu kopii genu (4).

Prawdopodobieństwo powstania kolejnych dwu mutacji somatycznych genu RB1, następujących kolejno w tej samej komórce siatkówki – jak się to dzieje w S sporadycznym – jest wprost proporcjonalne do długości życia komórki; tłumaczy to fakt pojawiania się takich guzów w późniejszym wieku aniżeli S wywołanych mutacją konstytucyjną, zwykle także jednostronnie i jednoogniskowo (ryc. 1). Zgodnie z mechanizmem „dwu trafień” w guzach powstałych u osób z mutacją konstytucyjną, wobec jej istnienia już od urodzenia, do ostatecznego powstania nowotworu konieczna jest w komórce siatkówki już tylko pojedyncza mutacja somatyczna. Zdarzenie takie ma szansę zaistnieć wcześniej – stąd młodszy wiek chorych z S dziedzicznym. Druga mutacja – somatyczna, u nosiciela zmiany konstytucyjnej zdarzyć się może w większej liczbie komórek – stąd częsta wieloogniskowość i obustronność tych guzów (1, 3).

S obustronne i jednostronne wieloogniskowe są zatem praktycznie zawsze związane z istnieniem mutacji konstytucyjnej, przekazanej rodzinnie lub nabytej de novo. Pojawiają się one w większości przypadków przed 3 r.ż. (ryc. 2). Mutacje konstytucyjne mogą jednak powstawać również jako zmiany germinalne d e novo (ryc. 3); związane z nimi guzy, pomimo iż rodowodowo sporadyczne, wykazują inne cechy kliniczne – w tym zwłaszcza wcześniejsze wystąpienie – podobne jak w nowotworach rodzinnych. Pewien odsetek chorych – jak wynika z naszych badań sięgający 20% – jest mimo jednostronności w chwili rozpoznania obciążony mutacją konstytucyjną (3, 5). Przypadki takie charakteryzują się (w stosunku do innych S jednostronnych) wcześniejszym wystąpieniem guza, wieloogniskowością i wysokim ryzykiem późniejszego pojawienia się nowego pierwotnego guza w tym samym lub drugim oku.

Gen RB1 o genowo średnich rozmiarach (200 kB), zlokalizowany w prążku 13q14 składa się z promotora i 27 eksonów, znany jest jeden transkrypt RNA o rozmiarach 4,8 kB; zjawisko alternatywnego składania RNA nie dotyczy więc zapewne genu RB1.

Kodowane przez ten gen białko p105RB1 należy do grupy tzw. białek kieszeniowych i jest jądrową fosfoproteiną, wielkości 105-110 kDa. Uczestniczy ono w złożonych kaskadach regulacyjnych, decydujących o przejściu komórek w cyklu komórkowym z fazy G₁ do fazy S a więc jest jednym z głównych regulatorów proliferacji. Dotyczy to wszystkich komórek ustroju a gen wykazuje znaczny konserwatyzm ewolucyjny. Białko oddziałuje na funkcję wielu innych genów przez unieczynnienie (sekwestrację) jednego z głównych regulatorów transkrypcji – czynnika E2F. Zdolność ta realizowana jest poprzez wiązanie E2F w „kieszeni” białka pRB1, uniemożliwiając czynnikowi E2F transaktywację innych podległych genów, co jest równoznaczne z utrzymaniem komórek w spoczynkowej fazie G_o. Tylko białko pRB1 z hipofosforylowanymi resztami serynowymi posiada zdolność wiązania E2F; hiperfosforylacja białka uwalnia czynnik transkrypcyjny i umożliwia przejście G1 – S i progresję cyklu komórkowego. Do kieszeni białka pRB1 wiążą się kompetencyjnie również niektóre białka takich wirusów onkogennych jak białko E7 papillomawirusa, białko E1A adenowirusa, antygen T wirusa SV40 i inne. Zjawisko to pozwala powiązać w sposób niesprzeczny procesy ontogenezy wirusowej z istnieniem nowotworów genetycznie uwarunkowanych. Kieszeń białka pRB1 może wiązać również wiele innych białek zawierających motyw -Leu-x-Cys-x-Glu- (1, 4, 6, 7, 8). Rozpoznane u chorych z S mutacje sekwencji zlokalizowane są najczęściej w kieszeni białkowej i jej najbliższej okolicy i wpływają na powinowactwo do czynników transkrypcyjnych, ale niekiedy nie blokują całkowicie ich wiązania – mają wtedy cechy mutacji o niskiej penetracji (p. niżej).

Uniwersalne mechanizmy regulacyjne realizowane przez białko pRB1 mogą tłumaczyć udział jego mutacji w powstawaniu także innych niż S nowotworów, jak kostniakomięsak, rak pęcherza, rak drobnokomórkowy płuc i in., współwystępujących niekiedy rodzinnie z siatkówczakiem (9).

Aktywność genu RB1 jest regulowana na poziomie promotora przez przypisane mu regulatory transkrypcji; nieliczne poznane dotąd mutacje promotora upośledzają tą regulację i mają kliniczne cechy mutacji o niskiej penetracji (p. niżej). Jedną z nich – i pierwszą znaną de novo – opisaliśmy w naszym Ośrodku (10).

Dla prawidłowej funkcji komórek wystarczająca jest aktywność pojedynczej kopii genu; nosiciele mutacji konstytucyjnych poza predyspozycją do S nie różnią się w uchwytny sposób od posiadaczy dwu prawidłowych kopii genu.

Szczyt zachorowań na S występuje ok. 42 miesiąca życia, ponad 90% przypadków rozpoznawanych jest po raz pierwszy przed 5 r.ż. Znane są sytuacje, w których guz ten wykrywano tuż po urodzeniu. Wczesnymi objawami klinicznymi nasuwającymi podejrzenie S są: zez, przekrwienie i stan zapalny gałki ocznej. Zazwyczaj rozpoznanie guza następuje jednak na podstawie objawów później występujących; są nimi exophthalmos i zaobserwowane przez rodziców tzw. „kocie oko”- przeświecanie umiejscowionych na siatkówce serowatych mas guza przez soczewkę. Identyfikacja nowotworu w okresie wczesnym pozwala często na wyleczenie z ubytkami pola widzenia i zachowaniem gałki ocznej. Identyfikacja późniejsza, niestety najczęstsza, oparta o stwierdzenie „kociego oka” wiąże się zwykle z koniecznością usunięcia gałki ocznej oraz nierzadko uzupełniającej radio- i chemioterapii (3, 4).

Stosunkowo rzadko S daje klasyczne przerzuty a szerzy się głównie przez ciągłość drogą n. wzrokowego. Rokowanie zależy w znacznym stopniu od standardu diagnostyki i opieki medycznej; w krajach rozwiniętych o dobrej tradycji medycznej śmiertelność rzadko przekracza 8% a konieczność usunięcia gałki ocznej ma miejsce w ok. 10% przypadków. W krajach słabo rozwiniętych obserwowano śmiertelność 100%.

Predyspozycja dziedziczna do siatkówczaka wiąże się z istnieniem konstytucyjnych mutacji genu RB1.

Pełny zakres badań molekularnych tego genu dostępny jest w naszym Ośrodku (8, 10-14). Diagnostyka sekwencji genu obciążona jest znacznymi kosztami. Wykazano jednak, że koszty te, ze względu na wyłączanie nosicielstwa u wielu potencjalnie predysponowanych członków rodzin, są niższe aniżeli koszty pełnej opieki profilaktycznej koniecznej u wszystkich dzieci w rodzinie, jeśli nie dokonaliśmy wyłączeń (15). Pełne sekwencjonowanie genu RB1 identyfikuje mutację w ok. 80% rodzin, w których S ma ewidentnie dziedziczny charakter. Pewnym ułatwieniem może być wstępne stosowanie metod preselekcyjnych jak SSC, DGGE, PTT; mają one jednak niższą czułość aniżeli sekwencjonowanie. Identyfikacja mutacji u osoby chorej pozwala następnie na weryfikację tylko wybranego fragmentu genu o pozostałych członków rodziny (4, 16). W diagnostyce wykorzystać można także analizy sprzężeń z wykorzystaniem molekularnych markerów wewnątrzgenowych; są one pomocne zwłaszcza w diagnostyce większych liczebnie rodzin (4, 10, 13, 17). Do diagnostyki S wdrożono nie tylko klasyczne PCR – sekwencjonowanie „ekson po eksonie” (17-20), ale także techniki takie jak multiplex i jakościowy multiplex -PCR (umożliwiające jednoczesną ocenę kilku eksonów „pakiecie”), jak i nowe techniki końcowej detekcji mutacji wywodzące się z biochemii np. HPLC (13, 14, 19, 21).

Źródłem diagnostyki DNA konstytucyjnego jest zwykle krew obwodowa a analizie podlega pozyskany z niej DNA. Materiał ten zawiera zarówno kodujące (eksony) jak i niekodujące (introny) części genu. Stosowanie jako materiału badanego RNA i przygotowanego in vitro na jego matrycy cDNA, zawierającego jedynie kodujące fragmenty DNA, ułatwia zarówno technikę badania jak i jego późniejszą interpretację (16). Diagnostyka DNA samego guza nie jest konieczna do identyfikacji mutacji konstytucyjnych, może jednak być potwierdzeniem prawidłowości procedur i źródłem cennych informacji o mutacjach somatycznych („drugich trafieniach” i „sporadycznych”).

Informacje o zaobserwowanych mutacjach gromadzone są w dwu bazach danych z wolnym dostępem on-line (18, 21). Baza danych Dr Lohmanna obejmuje mniejszą liczbę mutacji i jest obecnie rzadziej aktualizowana, umożliwia natomiast łatwe różnicowanie mutacji konstytucyjnych od somatycznych „drugich trafień”; w bazie Valverde i wsp., zawierającej więcej nowszych danych (932 mutacje), nie zawsze takie rozróżnienie jest możliwe. Jednakże właśnie analizy materiału tej drugiej bazy danych radykalnie zmieniły naszą wiedzę o charakterystyce konstytucyjnych mutacji genu RB1.

Uważano do niedawna, że mutacje te zlokalizowane są bez wyraźnych prawidłowości (16). Jak się jednak okazało w genie RB1 występują „gorące miejsca” nagromadzenia mutacji, odpowiadające czynnościowo ważnym okolicom białka pRB1 a zwłaszcza jego „kieszeni” – 79% powtarzających się mutacji to tranzycje C/T w 11 trypletach kodonów argininowych CGA z czego aż 40% jest zawartych w eksonach 8, 10, 11, 14, 15, 17, 18 i 23 (22). Obserwacje te znacząco modyfikują taktykę sekwencjonowania diagnostycznego, jego szybkość i koszty (21).

Przeważająca większość mutacji to, jak się spodziewano, zmiany uniemożliwiające skuteczną syntezę białka, bądź to unieczynniające je funkcjonalnie; są to zwłaszcza mutacje typu „stop” (42% obserwowanych), ale także dodatkowo niektóre mutacje typu delecji i „splicing site”.

W odróżnieniu od mutacji „inaktywujących”, mutacje modyfikujące funkcjonalność cząsteczki, ale nieblokujące całkowicie syntezy białka pRB są rozmieszczone losowo.