Termin proteomika po raz pierwszy został użyty w 1994 roku i w analogii do genomiki, oznaczał zakrojone na szeroką skalę badania mające na celu poznanie ogółu białek komórkowych (1). Dzisiaj proteomika zajmuje się również określaniem struktury, izoform oraz modyfikacji potranslacyjnych białek, badaniem mechanizmów aktywności, funkcji i usytuowania białek w szlakach metabolicznych komórki, a także analizą interakcji z innymi białkami, struktury tworzonych kompleksów oraz ich lokalizacji śródkomórkowej.

Jedną z podstawowych technik stosowanych w proteomice jest spektrometria mas (MS), ponieważ pozwala ona na pomiar masy cząsteczek w stężeniach attomolowych, do niedawna nieosiągalnych w analizie. Spektrometr mas składa się z trzech podstawowych części: źródła jonów, analizatora rozdzielającego jony pod względem stosunków ich masy do ładunku oraz detektora zliczającego liczbę jonów danego rodzaju. Bardzo szybki rozwój tej techniki został zapoczątkowany w latach 90-tych, dzięki wprowadzeniu nowych technik jonizacji, takich jak:

– jonizacja przez desorpcję laserową w matrycy (MALDI, ang. Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation), w której stosuje się jonizację wiązką laserową o tak dobranej energii, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (tzw. metoda łagodnej jonizacji), a jedynie do ich „wybijania” ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która następnie jest przekazywana do analizowanych cząsteczek (2),

– elektrorozpylanie (ESI, ang. Electrospray), polegające na rozpylaniu cieczy, zawierającej badaną substancję, w polu elektrycznym o wysokim napięciu (zwykle 1-5 kV). Jest to również technika łagodnej jonizacji – zwykle nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek (2).

Za pionierskie prace nad ESI i MALDI, John Fenn i Koichi Tanaki zostali uhonorowani w 2002 roku nagrodą Nobla w dziedzinie chemii (3). Dalsze zwiększenie czułości analiz w MS osiągnięto dzięki sprzężeniu ESI, a od niedawna również MALDI, z chromatografią cieczową (4).

Dzięki ogromnemu postępowi, jaki dokonuje się w technikach proteomicznych, a w szczególności w MS, proteomika jest powszechnie uważana za niezwykle obiecującą technologię w badaniach biomedycznych. Jednym z jej głównych zastosowań stało się poszukiwanie biologicznych markerów chorobowych. Szczególnie interesującym źródłem biomarkerów mogą być płyny ustrojowe. Będąc w stałym i bliskim kontakcie z tkankami, płyny ustrojowe stają się rezerwuarem polipeptydów wydzielanych przez tkanki, a ich skład zależy od metabolicznego stanu organizmu. Dodatkowo, pobieranie płynów ustrojowych cechuje niska inwazyjność i niewielkie koszty oraz łatwość przechowywania próbek i ich przetwarzania. Jednakże odkrycie nowych biomarkerów chorobowych wymaga zrozumienia specyfiki płynów ustrojowych oraz ścisłej standaryzacji wielu etapów analizy.

Liczba i skład polipeptydów w krwioobiegu zmienia się dynamicznie w zależności od stanu organizmu, odzwierciedlając zachodzące w nim zmiany, tak fizjologiczne, jak i chorobowe (5). Docierając do wszystkich regionów ciała, krew zbiera z tkanek wydzielane komórkowe białka i metabolity, stając się potencjalnie ważnym źródłem biomarkerów chorobowych.

Dla poszukiwania markerów białkowych we krwi ważny jest wybór czy źródłem białek będzie osocze czy też surowica, bowiem ich składy białkowe w dużym stopniu różnią się od siebie (6). Różnica ta wynika przede wszystkim z usunięcia z surowicy znacznych ilości fibrynogenu oraz białek specyficznie bądź niespecyficznie związanych z procesem wykrzepiania krwi.

Grupy badawcze skupione w międzynarodowej organizacji HUPO (ang. Human Proteome Organisation), na podstawie wyników otrzymanych w pilotażowej fazie projektu Proteom Osocza (ang. Plasma Proteome Project), rekomendują używanie do badań osocza zamiast surowicy krwi, ze względu na niższy poziom degradacji białek zachodzącej ex vivo, a tym samym większą stabilność składu białkowego próbek (7). Jednakże coraz częściej pojawiają się również opinie przemawiające za stosowaniem surowicy jako źródła potencjalnych biomarkerów peptydowych, właśnie ze względu na procesy zachodzące ex vivo, które według zwolenników stosowania do badań surowicy wydają się być jednym z mechanizmów generowania biomarkerów (8). Tak więc, oprócz wątpliwości: co i jak pobierać, jak transportować, jak przechowywać i jak wstępnie przygotowywać próbki do analizy, rodzi się kolejne pytanie: badać proteom czy peptydom, osocza czy surowicy?

W badaniach proteomów osocza i surowicy krwi w poszukiwaniu biomarkerów niezmiernie ważna jest powtarzalność eksperymentów i możliwość odtworzenia wyników analiz w innych ośrodkach badawczych. Badania własne i innych autorów wskazują, że czas i temperatura wykrzepiania krwi, wielokrotność rozmrażania i zamrażania próbek surowicy, a także rodzaj i ilość stosowanych inhibitorów proteaz (niektóre z nich mogą interferować z analizą w spektrometrze mas) mają znaczący wpływ na uzyskiwane wyniki analiz (9, 10). Cel, jaki stawia sobie HUPO, upowszechniając swoje wyniki i obserwacje, to m.in. opracowanie standardowych protokołów i metod, które umożliwią porównywanie wyników otrzymanych w różnych laboratoriach.

Proteomy surowicy i osocza krwi charakteryzuje złożony skład oraz dynamiczny zakres stężeń występujących w nich białek. Ich pełną analizę proteomiczną istotnie utrudnia obecność kilku białek, które występują w bardzo wysokich stężeniach. Do tych białek zaliczamy m.in. albuminę, immunoglobuliny, alfa-1-antytrypsynę, fibrynogen, transferynę oraz haptoglobinę. Szacuje się, że zaledwie 22 białka stanowią niemal 99% masy białkowej osocza i surowicy (ryc. 1). Sama albumina stanowi ponad 50% masy białkowej, a poziom jej stężenia w surowicy w porównaniu z białkami sygnałowymi, występującymi w ilościach śladowych, przekracza 10 rzędów wielkości (5). Podczas rutynowej analizy proteomicznej, peptydy uzyskiwane z białek najczęściej występujących całkowicie maskują obecność peptydów pochodzących z białek o niższym stężeniu, wśród których spodziewamy się znaleźć biomarkery. Dlatego też poszukiwanie potencjalnych biomarkerów peptydowych wymaga usunięcia z analizowanej mieszaniny białek występujących w niej w dużych stężeniach, np. poprzez stosowanie kolumn wypełnionych złożem z przeciwciałami skierowanymi przeciwko najczęściej występującym białkom krwi (6).

Prosty eksperyment z użyciem tandemowego spektrometru mas sprzężonego z wysokosprawną chromatografią cieczową (LC-MS/MS) zazwyczaj generuje listę kilkuset białek. Dla pełniejszej identyfikacji proteomu stosuje się złożone, wieloetapowe metody proteomiczne, które najczęściej obejmują wstępne frakcjonowanie białek, wielowymiarowy rozdział polipeptydów i ich ostateczną identyfikację w MS. W tabeli 1 przedstawiono przykłady różnych połączeń technik proteomicznych stosowanych w badaniach proteomów surowicy i osocza wraz z liczbą zidentyfikowanych w nich białek.

Do najczęściej stosowanych metod frakcjonowania białek osocza i surowicy należą: chromatografia cieczowa w odwróconej fazie (RPLC), chromatografia jonowymienna (kationowymienna SCX i anionowymienna AEC), chromatografia wykluczania (SEC), elektroforeza w denaturującym żelu poliakryloamidowym (SDS-PAGE), elektroforeza kapilarna (EC) i izoelektroogniskowanie (IEF) (6). Łączenie ze sobą różnych technik frakcjonowania może dodatkowo zwiększać ich rozdzielczość, pozwalając na wielowymiarowe frakcjonowanie próbek i dalsze upraszczanie ich składu białkowego przed analizą MS.

W projekcie HUPO/PPP przeprowadzono szereg porównań w celu uzyskania najbardziej wydajnej metody frakcjonowania białek, poprzedzającej analizę MS. Okazało się, że na identyfikację największej liczby białek surowicy pozwalają metody sprzężone z SCX oraz z IEF, ponadto każda z tych metod identyfikuje z osobna białka dla siebie unikatowe (12). W eksperymencie, w którym połączono IEF z LC-MS/MS zidentyfikowano w surowicy 844 peptydy, które odpowiadały 437 białkom (13), natomiast połączenie IEF z SCX i LC-MS/MS pozwoliło na rozpoznane aż 1444 białek (14). We wstępnym podsumowaniu projektu PPP, HUPO przedstawiła listę 9504 białek zidentyfikowanych na podstawie co najmniej jednego peptydu, w tym 3020 białek identyfikowanych na podstawie co najmniej dwóch peptydów (7).

Badanie niskocząsteczkowego proteomu osocza i surowicy zyskuje coraz większe zainteresowanie, gdyż uważa się, że to właśnie w tym obszarze proteomu, nazwanym peptydomem, mogą znajdować się nowe, jeszcze nie odkryte biomarkery. Za „niskocząsteczkową frakcję” proteomu krwi przyjęto uważać peptydy i białka o masie poniżej 30 kDa (15). W jej skład wchodzi szereg ważnych fizjologicznie białek, takich jak: cytokiny, chemokiny, białkowe hormony i czynniki wzrostu. Peptydy występujące w krwioobiegu mogą także powstawać jako produkty degradacji białek, w wyniku aktywności endogennych proteaz (16). Frakcję niskocząsteczkową proteomu krwi można otrzymać przez usunięcie polipeptydów o masie powyżej 30 kDa, stosując kolumny filtracyjne o takim punkcie odcięcia. W celu uwolnienia polipeptydów związanych przez wysokocząsteczkowe białka nośnikowe, filtrowanie przeprowadza się w warunkach denaturujących (15).

Wiele składników niskocząsteczkowego proteomu krwi jest związanych z białkami nośnikowymi, do których zaliczamy przede wszystkim albuminę. Uważa się, że albumina pełni rolę „gąbki molekularnej” dla peptydów i niskocząsteczkowych białek, dzięki czemu nie są one usuwane przez układ filtracyjny nerek i dłużej pozostają w krwioobiegu (17). Dla przykładu, w osoczu chorych na raka jajnika wyróżniono ponad 800 peptydów wiązanych przez albuminę, w tym fragmenty białka komórkowego BRCA2 (18). Wydaje się więc, że frakcja niskocząsteczkowych białek i peptydów wiązanych przez białka nośnikowe, może również stanowić ważne źródło potencjalnych biomarkerów chorobowych.

Izolowanie białek podlegających specyficznym modyfikacjom potranslacyjnym łańcuchów bocznych aminokwasów, stanowi jedno z możliwych podejść do badania białek obecnych we krwi w niskich stężeniach. Modyfikacje te odgrywają zasadniczą rolę w regulacji wielu podstawowych procesów biologicznych, a zaburzenie ich normalnego przebiegu ma wpływ na powstawanie wielu chorób, w tym również nowotworowych. Glikozylacja jest jedną z najczęściej występujących modyfikacji białek, a zmiany w składzie podstawianych reszt wielocukrowych wydają się być specyficzne dla różnych stanów chorobowych (19).

Znakomita większość białek wydzielanych przez komórki podlega glikozylacji, włączając w to znane już markery nowotworowe, jak PSA, CA125, CA19-9, CA15-3 czy CEA (19). Zidentyfikowanie glikozylowanych peptydów często wymaga jednak ich wzbogacenia przed analizą w spektrometrze mas. Stosuje się w tym celu chromatografię powinowactwa z użyciem lektyn (przy pomocy tej techniki zidentyfikowano ponad 150 glikozylowanych białek w osoczu i surowicy (20)), jak również chromatografię wykluczania (21). Możliwe jest także wcześniejsze enzymatyczne odłączenie reszt wielocukrowych od szkieletu polipeptydowego, przy pomocy glikozydazy F. Analiza otrzymanych w ten sposób reszt wielocukrowych przy użyciu elektroforezy dwukierunkowej (2D-E) i LC-MS/MS pozwoliła na zidentyfikowanie 2053 N-glikopeptydów, reprezentujących 303 glikoproteiny (22). Wykazano, że specyficzny skład wielocukrów obecnych w surowicy może charakteryzować chorych na raka gruczołu krokowego (23) i trzustki (24).

Wprowadzenie technologii proteomicznych i ciągłe ich udoskonalanie niesie nadzieję na ich zastosowanie w diagnostyce chorób. O rosnącym zainteresowaniu i zapotrzebowaniu na tego typu badania świadczy lawinowy wzrost liczby doniesień i publikacji na ten temat, ukazujących się w światowym piśmiennictwie w ostatnich latach.

Wyniki wielu badań wskazują na istnienie korelacji pomiędzy stężeniem pewnych białek lub peptydów we krwi, a stanem chorobowym badanych osób. Obiecujące wydają się wyniki analiz proteomu surowicy pacjentów cierpiących na choroby autoimmunologiczne (25, 26, 27). Wykazano, że u chorych z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby (WZW) typu B, określone profile proteomiczne krwi (skład białkowy) korelują ze stopniem zwłóknienia wątroby oraz umożliwiają różnicowanie między zwłóknieniem a marskością wątroby (28). Wśród białek, których zmienność koreluje ze stopniem morfologicznego uszkodzenia wątroby w przebiegu WZW typu B, znajdowano apolipoproteiny A-I i A-IV, alfa-1-antytrypsynę, transtyretynę i topoizomerazę II (29). Podobne zależności obserwowano również dla glikozylowanych białek krwi: osoczowego amyloidu P i ceruloplazminy (30). Z kolei, u chorych z rakiem wątrobowo-komórkowym wykazano zmiany glikozylacji białka GP73 (31).