Apoptoza, czyli proces programowanej śmierci komórki, jest ważną reakcją obronną organizmu w przebiegu zakażeń wirusowych i nowotworów. Wydaje się, że mechanizm ten w znaczącym stopniu może przyczyniać się do hamowania rozprzestrzeniania wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) w organizmie zakażonych osób, a nawet prowadzić do eliminacji zakażenia HCV. Z drugiej strony pojawiają się doniesienia sugerujące, że apoptoza umożliwia wirusowi uniknięcie odpowiedzi ze strony układu immunologicznego. Wyniki dotychczas wykonanych badań znacznie się różnią co do nasilenia i roli HCV w indukowaniu apoptozy komórek in vivo i in vitro. Dlatego celowe może być krótkie podsumowanie stanu wiedzy w związku pomiędzy HCV i apoptozą komórek.

Apoptoza (programowana śmierć komórkowa typu I) jest jednym z podstawowych procesów odpowiedzialnych za ograniczenie rozprzestrzeniania zakażeń wirusowych w organizmie. W odróżnieniu od innych procesów niszczenia komórek podlega ścisłej kontroli i nie wywołuje odczynu zapalnego (1).

Apoptoza dotyczy wybranych komórek, które uruchamiają wewnętrzne mechanizmy samozniszczenia („komórkowe samobójstwo”), a jej skutkiem jest usunięcie zakażonej, wadliwie funkcjonującej lub niepożądanej komórki (1, 2).

Proces apoptozy rozpoczyna etap indukcji, który może przebiegać odmiennie, zależnie od rodzaju czynnika działającego na komórkę. Kolejną fazą jest uruchomienie etapu egzekucji, doprowadzającego do rozpadu i usunięcia resztek ginącej komórki. Mimo że etap końcowy apoptozy jest zawsze taki sam, to pobudzenie może pochodzić z bardzo różnych źródeł. Najogólniej wyróżnia się dwa główne szlaki indukcji apoptozy: wewnątrz- i zewnątrzpochodny.

Jednym z najważniejszych powodów wejścia komórki na szlak wewnątrzpochodny są uszkodzenia DNA, najczęściej powodowane przez czynniki fizykochemiczne, takie jak promieniowanie jonizujące, wolne rodniki, alkile itp. (3). Innymi istotnymi czynnikami są zaburzenia proliferacji komórek, które mogą być wywołane przez inaktywację supresorów nowotworowych, aktywację onkogenów oraz przez zakażenia wirusowe (4, 5, 6). Indukcja wewnątrzpochodna może być także wywoływana przez niedotlenienie, brak kontaktu z macierzą oraz hormony, takie jak glikokortykoidy (7, 8). W efekcie dochodzi do zwiększenia przepuszczalności zewnętrznej błony mitochondrialnej i uwolnienia cytochromu c, który aktywuje prokaspazy, wprowadzając komórkę w fazę egzekucji.

Szczególną rolę w indukcji apoptozy po wystąpieniu czynników stymulujących, związanych z uszkodzeniami DNA, ma białko p53. Stanowi ono podstawową barierę dla pojawiających się komórek stransformowanych nowotworowo, ponieważ blokuje podział komórki. Mechanizm działania p53 obejmuje aktywację inhibitora cyklu komórkowego CDK (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A lub inaczej p21) w przypadku pojawienia się jakichkolwiek uszkodzeń w DNA. Białko p53 może indukować ekspresję proapoptotycznych białek z rodziny Bcl-2, które działają na mitochondrium, stymulując je do uwolnienia cytochromu c i czynnika wywołującego apoptozę (AIF – apoptosis inducting factor), co w konsekwencji prowadzi do aktywacji prokaspaz (1, 2, 9, 10, 11, 12).

Szlak zewnątrzpochodny zostaje uruchomiony pod wpływem oddziaływań z innymi komórkami oraz wydzielanymi przez nie białkami (TNF-α – tumor necrosis factor-α, Fas-Ligand oraz TRAIL – tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand). Białka te mogą występować w postaci wolnej lub być związane z komórkami (komórki NK lub limfocyty T cytotoksyczne). Receptory dla TNF, Fas-L i TRAIL są niekiedy nazywane receptorami śmierci. Posiadają część zewnątrzkomórkową oraz wewnątrzkomórkową, wyposażoną w tzw. DD (death domain). Po przyłączeniu odpowiedniego białka receptory te łączą się ze sobą i umożliwiają wiązanie innych cząsteczek DD, które wchodzą w skład białek adaptorowych, takich jak FADD (Fas-associated death domain) lub TRADD (TNFR1-associated death domain protein). Białka adaptorowe po związaniu swoich DD z cząstkami DD receptorów śmierci tworzą kompleks sygnalizujący apoptozę (death inducing signalling complex – DISC). Aktywują prokaspazę 8, która w formie aktywnej zapoczątkowuje kaskadę kaspaz i tym samym egzekucję apoptozy.

Opisano szereg białek, które przekazują sygnał od receptorów śmierci, aktywując kinazy lub białka pośrednie, są to m.in. RAIDD (receptor-interacting protein [RIP] – associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a death domain), CARD (caspase recruitment domain) oraz RIP (receptor-interacting protein). Niekiedy szlak zewnątrzpochodny może zostać włączony przez działanie hormonów (7, 8, 13).

Faza egzekucji charakteryzuje się występowaniem kolejnych stadiów morfologicznych: uwolnienia, uwypuklenia i kondensacji. Podczas stadium uwolnienia komórka traci połączenia z innymi komórkami, odrywa się od podłoża (macierzy) i przybiera kulisty kształt. Kontakt z podłożem jest szczególnie ważny w przypadku komórek nabłonkowych (jego utrata prowadzi do apoptozy zwanej anoikis). Następnie dochodzi do upośledzenia i w konsekwencji zniszczenia układów odpowiedzialnych za naprawę DNA. Kluczową rolę odgrywa zależna od kaspaz proteoliza enzymów naprawiających DNA oraz inhibitorów nukleaz CAD (caspase activated DNAse), czyli ICAD (inhibitor of caspase activated DNAse). Prowadzi to do cięcia DNA przez nukleazy na fragmenty o długości 180 nukleotydów lub ich wielkorotności. Degradacja szkieletu komórkowego przez kaspazy wprowadza komórkę w stadium uwypuklenia. W błonie komórkowej pojawiają się pączkujące wybrzuszenia, w których zamykają się fragmenty chromatyny oraz organelle komórkowe. Rozpoczyna się stadium kondensacji, w którym pączkujące ciałka apoptotyczne odrywają się od ginącej komórki. Ostatecznie dochodzi do całkowitego rozpadu komórki i fagocytozy ciałek apoptotycznych przez komórki żerne (1, 9).

Inną odmianą programowanej śmierci komórek jest autofagia (programowana śmierć komórkowa typu II) lub inaczej APCD (autophagic programmed cell death). Jest to mało znany proces opierający się na działaniu autofagosomów – cytoplazmatycznych pęcherzyków zbudowanych z podwójnej błony białkowo-lipidowej. Proces ten jest wywoływany najczęściej niedostatkiem aminokwasów, niedotlenieniem lub temperaturą. Autofagia wykorzystuje zjawisko autofagocytozy, która umożliwia chwilowe podtrzymanie procesów życiowych komórek kosztem ich własnych organelli i struktur i w odróżnieniu od apoptozy nie obejmuje aktywacji kaskady kaspaz. Główną rolę w autofagii odgrywają autolizosomy – pęcherzyki zbudowane z błony białkowo-lipidowej, powstające z połączenia lizosomów z autofagosomami. Autolizosomy trawią zamknięte w swoim wnętrzu organelle i białka macierzystej komórki (14, 15).

Alternatywnym sposobem usuwania komórek jest nekroza (martwica) stanowiąca bierną reakcję na ekstremalnie niekorzystne warunki otoczenia (głównie temperaturę i promieniowanie). Najbardziej charakterystyczny dla nekrozy jest brak jakiejkolwiek kontroli procesu niszczenia ze strony organizmu. Cechuje się bezładnym, nieskoordynowanym rozpadem, podczas którego dochodzi do pęknięcia błony komórkowej i wycieku cytoplazmy wraz z organellami na zewnątrz komórki. Nekroza dotyczy zwykle grup komórek i wiąże się z wystąpieniem silnej reakcji zapalnej (16, 17).

Komórki zakażone HCV oraz krążące wolno wiriony stanowią cel ataku układu immunologicznego. Podstawową linią obrony HCV, podobnie jak większości RNA-wirusów, jest szybka replikacja oraz duża zmienność (1, 18, 19). Istotną rolę odgrywa też zdolność HCV do wpływu na szlaki sygnałowe w procesie apoptotycznym. Dotychczas nie udało się jednak stwierdzić jednoznacznie, jak duży wpływ wywiera wirus na ten proces w zakażonych komórkach. Wynika to z faktu, że nie uzyskano jak dotąd dobrego modelu doświadczalnego in vitro, który pozwoliłby prowadzić badania nad przebiegiem zakażenia HCV (19).

Istnieją dowody wpływu zakażenia HCV na proces apoptozy, zarówno o charakterze hamującym, jak i stymulującym, wreszcie są też doniesienia sugerujące zupełny brak wpływu wirusa na apoptozę (20). Efekt, jaki wywiera wirus, zależy prawdopodobnie od rodzaju komórki, stanu jej pobudzenia oraz ewentualnej koinfekcji z innym patogenem (21, 22).

Jedno białko HCV może pełnić zupełnie odmienne funkcje i – jak wykazano – ekspresja czynnika NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), pełniącego rolę regulatora cyklu komórkowego, może być modulowana przez białko rdzenia wirusa – core. Hamowanie ekspresji NF-κB przez to białko w komórkach, takich jak limfocyty T, osłabia odpowiedź ze strony układu immunologicznego na zakażenie HCV, natomiast jego aktywacja może przyczyniać się do rozwoju pierwotnego raka wątrobowokomórkowego (HCC) (23).

Badania wykorzystujące linie hepatocytów wykazały, że białkami najczęściej odpowiedzialnymi za modyfikację szlaku sygnałowego apoptozy są białka rdzenia wirusa (24). Dojrzałe białko rdzenia lokalizuje się głównie w cytoplazmie, uzyskując dostęp do większości szlaków sygnałowych i procesów zachodzących w komórce (25). Zaobserwowano 15-krotny wzrost procesów apoptotycznych i nekrotycznych, zachodzący w komórkach linii HepG2 (human hepatocellular liver carcinoma cell line) z wszczepionym genem białka rdzenia wirusa, w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Wykazano także zależność pomiędzy wielkością białka oraz budową jego domen a wpływem na procesy apoptotyczne, przy czym im dłuższy jest fragment białka rdzenia, tym nasilenie obserwowanych procesów jest większe (25). Również badania na linii hepatocytów Huh7 (human hepatoma cell line) potwierdzają indukujący wpływ białka rdzenia na procesy apoptotyczne. Zaobserwowano, że komórki Huh7 charakteryzujące się odpornością na sygnał niesiony przez białko TRAIL stają się po wprowadzeniu białka core wrażliwe na apoptozę indukowaną przez TRAIL. Działanie białka wirusowego następuje przez aktywację kaspazy-8, co prowadzi do uruchomienia kaskady kaspaz i apoptozy. Zaobserwowano również, że w komórkach z wprowadzonym białkiem rdzeniowym HCV następuje silne uwalnianie cytochromu c z mitochondriów, który również wpływa na pobudzenie kaskady kaspaz. Białko wirusa nie wpływa więc na sam receptor dla TRAIL (TRAIL-R), lecz wydaje się katalizatorem apoptozy przy minimalnym sygnale przekazywanym przez TRAIL-R (26).

Wpływ HCV na szlaki sygnałowe apoptozy zbadano również w komórkach układu immunologicznego, zwłaszcza w limfocytach T (27). Świeżo izolowane komórki wykazują znaczny wzrost apoptozy u pacjentów z zakażeniem przewlekłym w porównaniu z grupami kontrolnymi. Również ekspresja Fas przez te komórki jest zwiększona, prawdopodobnie dlatego, że limfocyty T w przebiegu zakażenia przewlekłego są ciągle stymulowane antygenami HCV. Jednak stopień tej stymulacji, biorąc pod uwagę różnorodność antygenów HCV, nie jest jednakowy (27). Niektórzy badacze zaobserwowali ogólny spadek liczby komórek dendrytycznych i obniżenie ich zdolności do aktywacji limfocytów T, komórek NK oraz produkcji IL-12 i TNFα, w obecności HCV (28). Zjawisko to może być wynikiem działania procesów apoptotycznych.

Stwierdzono także, że poziom nasilenia apoptozy w hepatocytach jest proporcjonalny do poziomu zwłóknienia wątroby. Wyjaśnienie tych zależności nie jest niestety znane. Nie zaobserwowano natomiast korelacji między poziomem apoptozy a wiekiem, płcią, aktywnością transaminaz, czy wartością wiremii HCV (29).