© Borgis - Balneologia Polska 1/2006, s. 17-24
Jadwiga Jośko1, Aleksander Sieroń2, *Janusz Kasperczyk1, Mirosław Tyrpień1, Mariusz Adamek2, Katarzyna Stęplewska3, Karolina Sieroń-Stołtny2, Grzegorz Cieślar2
Wpływ zmiennych pól magnetycznych o niskich wartościach indukcji na ekspresję VEGF, angiogenezę oraz gojenie się owrzodzeń postresowych u szczurów
Influence of microtesla variable megnetic fields on healing of stress ulcer of stomach, angiogenesis and expression of vegf in rats
1 z Katedry i Zakładu Medycyny i Epidemiologii Środowiskowej Śląskiej Akademii Medycznej w Zabrzu
Kierownik Katedry: dr hab. n. med. Jadwiga Jośko
2 z Katedry i Kliniki Chorób Wewnętrznych, Angiologii i Medycyny Fizykalnej Śląskiej Akademii Medycznej w Bytomiu
Kierownik: prof. dr hab. n. med. Aleksander Sieroń
3 z Katedry i Zakładu Patomorfologii Śląskiej Akademii Medycznej w Zabrzu
Kierownik: dr hab. n. med. Andrzej Gabriel
Streszczenie
Celem pracy było wykazanie wpływu zmiennych pól magnetycznych o niskich wartościach indukcji na ekspresję naczyniowego czynnika wzrostu śródbłonka (VEGF), nasilenie procesu angiogenezy i gojenie się ostrych postresowych owrzodzeń żołądka u szczurów. Do badań użyto 48 dojrzałych szczurów, samców szczepu Wistar podzielonych losowo na 6 grup. 2 grupy kontrolne stanowiły zwierzęta niepoddane działaniu stresu, przy czym w jednej z tych grup stosowano magnetostymulację, a druga nie była poddawana działaniu pola magnetycznego. W kolejnych 2 grupach zwierząt odpowiednio 24 i 48 godzin po zadziałaniu stresu prowadzono badania żołądka. Ostatnie 2 grupy zwierząt były poddawane magnetostymulacji z wykorzystaniem zmiennego pola magnetycznego o indukcji 10 ?T trwającej 72 minuty odpowiednio bezpośrednio oraz 24 godziny po zadziałaniu stresu, a następnie u zwierząt tych prowadzono identyczne jak w poprzednich grupach badania żołądka odpowiednio 24 i 48 godzin po zadziałaniu stresu. W celu wywołania ostrych owrzodzeń błony śluzowej żołądka szczurów zastosowano stres immobilizacyjny w klatkach immobilizacyjnych Bollmana polegający na unieruchomieniu zwierzęcia na okres 3,5 godziny. Do oceny stopnia uszkodzenia błony śluzowej żołądka, posłużono się metodą planimetryczną. W celu porównania wielkości owrzodzeń między poszczególnymi grupami zwierząt zastosowano indeks owrzodzeń, który obliczano jako iloraz powierzchni owrzodzeń do całkowitej powierzchni części gruczołowej błony śluzowej żołądka. W uzyskanych skrawkach mierzono największą głębokość owrzodzenia w mm oraz oceniano głębokość owrzodzenia w stosunku do grubości blaszki właściwej błony śluzowej żołądka. Ekspresję VEGF oceniano za pomocą badania immunohistochemicznego skrawków przy użyciu przeciwciała anty-VEGF na podstawie liczby komórek wykazujących dodatnią ekspresję VEGF na 100 analizowanych komórek. Nasilenie angiogenezy w skrawkach oceniano na podstawie liczby wybarwionych czynnikiem von Willebrandta mikronaczyń na 1 mm2. Nie stwierdzono istotnych różnic w zakresie analizowanych parametrów pomiędzy grupami szczurów poddanych magnetostymulacji, a odpowiadającymi im grupami zwierząt, których po stresie nie poddawano działaniu pola magnetycznego. Na podstawie wyników przedstawionych badań wykazano, że zmienne pola magnetyczne o niskich wartościach indukcji nie wpływają na gojenie się postresowych owrzodzeń błony śluzowej żołądka, nasilenie angiogenezy oraz ekspresję VEGF u szczurów w okresie do 48 godzin po działaniu czynnika stresowego.
Wstęp
Błona śluzowa żołądka jest nieustannie narażona na działanie endo- i egzogennych czynników uszkadzających, prowadzących do zaburzenia jej integralności. Przejawem tego uszkodzenia jest powierzchniowa nadżerka, krwawe wybroczyny i ostatecznie głęboki ubytek w postaci owrzodzenia.
Owrzodzenia postresowe błony śluzowej żołądka są poważną komplikacją u pacjentów z rozległymi oparzeniami i u osób, które przebyły zabiegi operacyjne, zwłaszcza ośrodkowego układu nerwowego (12). Samoczynne gojenie owrzodzeń błony śluzowej żołądka jest skomplikowanym, wieloetapowym procesem obejmującym formowanie ziarniny, angiogenezę i regenerację nabłonka (5, 6). Prowadzone na zwierzętach badania dowodzą, że zachodząca podczas gojenia owrzodzeń angiogeneza, warunkuje prawidłową i wysoką jakość tego procesu, gdyż zapewnia dostarczenie tlenu i składników odżywczych do uszkodzonego obszaru. Z danych literaturowych wynika także, że ekspresja naczyniowego czynnika wzrostu śródbłonka (VEGF) jest w owrzodzeniach żołądka znacznie podwyższona i wywiera wpływ cytoprotekcyjny (4, 6, 14).
Na podstawie badań eksperymentalnych i klinicznych, wiadomo również, że w leczeniu choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy, zastosowanie zmiennych pól magnetycznych niskiej częstotliwości pozytywnie wpływa na gojenie się niszy wrzodowej (1, 7, 8, 9, 10).
Do tej pory nie wiadomo jednak, jaki wpływ mają zmienne pola magnetyczne o różnych wartościach indukcji na gojenie się owrzodzeń postresowych i czy można wiązać działanie pól magnetycznych ze zmianami w ekspresji czynników wzrostowych. Nie wiadomo również, jaki wpływ wywierają zmienne pola magnetyczne na angiogenezę w owrzodzeniach postresowych.
Celem pracy było wykazanie wpływu zmiennych pól magnetycznych o niskich wartościach indukcji na ekspresję naczyniowego czynnika wzrostu śródbłonka (VEGF), nasilenie procesu angiogenezy i gojenie się ostrych postresowych owrzodzeń żołądka u szczura.
Materiał i metody
Zwierzęta
Do badań użyto 48 dojrzałych szczurów, samców szczepu Wistar pochodzących z Centralnej Zwierzętarni Doświadczalnej Śląskiej Akademii Medycznej. Przez cały okres trwania badania zwierzęta przebywały w zwierzętarni Katedry i Zakładu Medycyny i Epidemiologii Środowiskowej, w standardowych warunkach mikroklimatycznych, w 12-godzinnym cyklu dzienno-nocnym (oświetlenie w godzinach 7.00-19.00), z wolnym dostępem do wody i standardowej paszy granulowanej typu Labofed B, po jednym osobniku w klatce. Zwierzęta podzielono losowo na 6 grup nie różniących się znamiennie pod względem masy ciała (tab. 1).
Tabela 1. Podział zwierząt na grupy eksperymentalne.
| Grupa | Liczba zwierząt | Opis skrócony | Opis pełny |
| I | 8 | Kontrola | Grupa kontrolna - zdrowe zwierzęta, u których zbadano ekspresję VEGF oraz angiogenezę |
| II | 8 | K+P-24 | Zwierzęta niestresowane poddane oddziaływaniu zmiennych pól magnetycznych, u których po 24 h żołądki poddano dalszym badaniom. |
| III | 8 | S-24 | Zwierzęta poddane stresowi immobilizacyjnemu, u których po 24 h żołądki poddano dalszym badaniom. |
| IV | 8 | S+P-24 | Zwierzęta poddane stresowi immobilizacyjnemu oraz oddziaływaniu zmiennych pól magnetycznych, u których po 24 h żołądki poddano dalszym badaniom. |
| V | 8 | S-48 | Zwierzęta poddane stresowi immobilizacyjnemu, u których po 48 h żołądki poddano dalszym badaniom. |
| VI | 8 | S+P-48 | Zwierzęta poddane stresowi immobilizacyjnemu oraz oddziaływaniu zmiennych pól magnetycznych u których po 48 h żołądki poddano dalszym badaniom. |
Protokół stresu
W celu wywołania ostrych owrzodzeń błony śluzowej żołądka szczurów zastosowano stres immobilizacyjny w klatkach immobilizacyjnych Bollmana wg. Takagi i wsp. (2) w modyfikacji Ernsta i wsp. (3), polegający na unieruchomieniu zwierzęcia na okres 3,5 godziny. W każdym przypadku ekspozycja na stres odbywała się o tej samej porze dnia.
Procedura ekspozycji w zmiennym polu magnetycznym
Bezpośrednio po zakończeniu stresu immobilizacyjnego zwierzęta były poddane oddziaływaniu zmiennego pola magnetycznego o niskiej wartości indukcji (microTesla variable magnetic field), generowanego przez aparat Viofor JPS produkcji firmy Med&Life Polska.
Zmienne pole magnetyczne generowane przez aparat Viofor JPS charakteryzuje się złożonym przebiegiem z widmem wielowierzchołkowym zbliżonym do piłokształtnego. Widmo pola składa się z 2 rodzajów impulsów o częstotliwości podstawowej 180-195 Hz i czasie trwania 5 ms, które połączone są w grupy i paczki, tak że ich obwiednia czyli częstotliwość nośna nie przekracza kilkunastu Hz. Składowa elektryczna pola w aplikatorze jest zbliżona do pola ziemskiego (130 V/m), natomiast składowa magnetyczna wynosiła w doświadczeniu 120 mT.
Ekspozycja była przeprowadzona w walcowatej cewce indukcyjnej, generującej jednorodne zmienne pole magnetyczne o ściśle określonym natężeniu i przebiegu w czasie (M2P2). Czas trwania ekspozycji dla zwierząt, u których ocenę stanu żołądka prowadzono 24 godziny po stresie immobilizacyjnym (grupa IV) oraz zwierząt poddawanych jedynie ekspozycji na pole, bez poprzedzającego stresu immobilizacyjnego (grupa II), wynosił 72 minuty, co odpowiadało 6 pełnym cyklom terapeutycznym aparatu. Zwierzęta, u których ocenę stanu żołądka prowadzono po 48 godzinach (grupa VI), zostały poddane 72-minutowej ekspozycji na pole dwukrotnie, tj. bezpośrednio po zakończeniu stresu oraz 24 godziny po jego ustaniu.
Ocena powierzchni owrzodzeń żołądka
Wszystkie zwierzęta zostały uśmiercone poprzez dootrzewnowe podanie pentobarbitalu (Morbital – Biowet Puławy) w dawce 75 mg/kg masy ciała.
Do oceny stopnia uszkodzenia błony śluzowej żołądka, posłużono się metodą planimetryczną (11).
Wyizolowany żołądek rozcięto wzdłuż krzywizny większej i po wypłukaniu silnym strumieniem roztworu soli fizjologicznej rozpięto na płytce parafinowej za pomocą szpilek. Po ocenie makroskopowej, powierzchnia żołądka została sfotografowana. Po obróbce diapozytywu, używając rzutnika do przezroczy uzyskano 100-krotne powiększenie obrazu, który odrysowano na arkusz papieru. Całkowitą powierzchnię części gruczołowej błony śluzowej żołądka oraz sumę powierzchni poszczególnych owrzodzeń uzyskano jako średnią z dwukrotnego pomiaru dokonanego za pomocą planimetru biegunowego PL-1/PZO, po uwzględnieniu faktycznej powierzchnię obrazu (11).
Aby porównać wielkość owrzodzeń między poszczególnymi grupami zwierząt zastosowano indeks owrzodzeń, który obliczano jako iloraz powierzchni owrzodzeń do całkowitej powierzchni części gruczołowej błony śluzowej żołądka.
Metodyka badań histopatologicznych
Rozpięte na płytce parafinowej żołądki utrwalane były w 10% formalinie przez 24 h. Po utrwaleniu pobierano 2 wycinki z makroskopowo widocznymi owrzodzeniami. Pobrane wycinki były następnie odwadniane, prześwietlane oraz zatapiane w parafinie w sposób standardowy. Następnie skrojono skrawki grubości ok. 5 ?m, które zabarwiono hematoksyliną i eozyną.
Ocena głębokości owrzodzeń
Po skrojeniu seryjnych skrawków mierzono największą głębokość owrzodzenia w mm oraz oceniano głębokość owrzodzenia w stosunku do grubości blaszki właściwej błony śluzowej żołądka.
Badanie immunohistochemiczne
Badanie immunohistochemiczne przeprowadzono na skrawkach parafinowych błony śluzowej żołądka grubości ok. 5 μm, wykorzystując przeciwciało anty-VEGF (C-1), sc-7269 K firmy Santa Cruz Staining System. Zastosowane przeciwciało monoklonalne swoiste dla VEGF nie reagowało krzyżowo z innymi czynnikami wzrostu z rodziny „śródbłonkowy czynnik wzrostu/łożyskowy czynnik wzrostu” (VEGF/PlGF). Przeciwciało anty-VEGF wiązało się z podstawową formą VEGFA, z epitopem odpowiadającym pierwszym 140 aminokwasom wszystkich izoform.
Po odparafinowaniu skrawków tkankowych przystąpiono do gotowania ich dwukrotnie po 5 minut w temperaturze 95°C w roztworze buforu cytrynianowego o pH 6,0. Po ostudzeniu skrawków zablokowana została endogenna peroksydaza 3% roztworem nadtlenku wodoru przez 5 minut. Kolejne etapy następowały w temperaturze pokojowej. Przez okres 20 minut skrawki były inkubowane z surowicą blokującą, następnie przez 3 godziny nastąpiło inkubowanie ich z przeciwciałem pierwotnym, a przez kolejne 30 minut z przeciwciałem wtórnym. Następnie skrawki były inkubowane z kompleksem peroksydaza chrzanowa – streptawidyna przez 30 minut i z substratem peroksydaza – diaminobenzydyna (DAB) przez 5 minut.
Po zakończeniu tych wszystkich procedur skrawki zostały spłukane, podbarwione hematoksyliną Meyera i zamknięte w balsamie kanadyjskim.
Ocena reakcji VEGF
Reakcję oceniano licząc komórki wykazujące dodatnią ekspresję białka VEGF (reakcja cytoplazmatyczna) na 100 komórek w 3 dużych polach widzenia (400x).
Ocena angiogenezy
Badanie zostało przeprowadzone na skrawkach parafinowych błony śluzowej żołądka grubości 5 μm. Wytworzone w procesie angiogenezy nowe naczynia krwionośne zostały wykryte dzięki zastosowaniu przeciwciał przeciwko czynnikowi von Willebranda (DAKO, Denmark), a ich gęstość oceniano licząc ilość wybarwionych czynnikiem von Willebrandta mikronaczyń w 3 polach, każde o powierzchni 1 mm kwadratowego.
Opracowanie statystyczne
Uzyskane wyniki po wprowadzeniu do bazy danych analizowano za pomocą pakietu „Statistica”. Ze względu na niejednorodne wariancje wykorzystano nieparametryczny test U Manna-Whitney´a dla prób niezależnych. Znamienność statystyczną uzyskanych różnic przyjęto dla p<0,05.
Wyniki
1. Indeks owrzodzeń i głębokość owrzodzeń (wartość bezwzględna w mm oraz względem grubości blaszki właściwej błony śluzowej żołądka)
Wartości indeksu owrzodzeń oraz głębokości owrzodzeń w poszczególnych grupach zwierząt wraz z oceną statystyczną przedstawiają tabele 2-4 i ryciny 1-3.
Tabela 2. Wartości indeksu owrzodzeń (średnia ± SD) w poszczególnych grupach zwierząt wraz z oceną statystyczną (wartości p dla różnic pomiędzy tymi grupami).
| Grupa | I
Kontrola | II
K+P-24 | III
S-24 | IV
S+P-24 | V
S-48 | VI
S+P-48 |
| Indeks owrzodzeń | 0,000 ? 0,000 | 0,001 ? 0,039 | 0,915 ? 0,341 | 0,904 ? 0,235 | 0,967 ? 0,232 | 0,976 ? 0,296 |
| I | | | | | | |
| II | nieistotne | | | | | |
| III | 0,000778 | 0,000778 | | | | |
| IV | 0,000778 | 0,000778 | nieistotne | | | |
| V | 0,000778 | 0,000778 | nieistotne | nieistotne | | |
| VI | 0,000778 | 0,000778 | nieistotne | nieistotne | nieistotne | |
Tabela 3. Wartości głębokości bezwzględnej owrzodzeń [mm] (średnia ± SD) w poszczególnych grupach zwierząt wraz z oceną statystyczną (wartości p dla różnic pomiędzy tymi grupami).
| Grupa | I
Kontrola | II
K+P-24 | III
S-24 | IV
S+P-24 | V
S-48 | VI
S+P-48 |
| Głębokość [mm] | 0,000 ? 0,000 | 0,000 ? 0,000 | 0,700 ? 0,283 | 0,700 ? 0,329 | 0,437 ? 0,373 | 0,450 ? 0,262 |
| I | | | | | | |
| II | nieistotne | | | | | |
| III | 0,000778 | 0,000778 | | | | |
| IV | 0,000778 | 0,000778 | nieistotne | | | |
| V | 0,003276 | 0,003276 | nieistotne | nieistotne | | |
| VI | 0,003276 | 0,003276 | nieistotne | nieistotne | nieistotne | |
Tabela 4. Wartości względnej głębokości owrzodzeń mierzonej w stosunku do grubości blaszki właściwej błony śluzowej (średnia ± SD) w poszczególnych grupach zwierząt wraz z wartościami p dla różnic pomiędzy tymi grupami.
| Grupa | I
Kontrola | II
K+P-24 | III
S-24 | IV
S+P-24 | V
S-48 | VI
S+P-48 |
| Głębokość względna | 0,000 ? 0,000 | 0,000 ? 0,000 | 0,841 ? 0,172 | 0,821 ? 0,153 | 0,509 ? 0,247 | 0,507 ? 0,169 |
| I | | | | | | |
| II | nieistotne | | | | | |
| III | 0,000778 | 0,000778 | | | | |
| IV | 0,000778 | 0,000778 | nieistotne | | | |
| V | 0,000778 | 0,000778 | 0,018130 | 0,020863 | | |
| VI | 0,000778 | 0,000778 | 0,007406 | 0,005385 | nieistotne | |
Ryc. 1. Indeks owrzodzeń w poszczególnych grupach zwierząt: I – kontrola, II – K+P-24, III – S-24, IV – S+P-24, V – S-48, VI – S+P-48.
Ryc. 2. Głębokość owrzodzeń w milimetrach [mm] w poszczególnych grupach zwierząt: I – kontrola, II – K+P-24, III – S-24, IV – S+P-24, V – S-48, VI – S+P-48.
Ryc. 3. Głębokość owrzodzeń względem grubości blaszki właściwej błony śluzowej w poszczególnych grupach zwierząt: I – kontrola, II – K+P-24, III – S-24, IV – S+P-24, V – S-48, VI – S+P-48.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Sieroń A., i wsp. (Sieroń A. red.): Zastosowanie pól magnetycznych w medycynie. á-medica press, Bielsko-Biała 2002.
2. Takagi K., et al.: Studies on the drugs for peptic ulcer. A reliable method for producing stress ulcer in rats. Chem. Pharm. Bull., 1964, 12, 465-472.
3. Ernst H., et al.: Effect of local injection with basic fibroblast growth factor (bFGF) and neutralizing antibody to bFGF on gastric ulcer healing, gastric secretion, angiogenesis and gastric blood flow. Sierot. Physiol. Pharmacol., 2001, 52, 377-390.
4. Ma L., et al.: Platelets modulate gastric ulcer healing: role of endostatin and vascular endothelial growth factor release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 22, 98, 6470-6475.
5. Milani S., Calabro A.: Role of growth factors and their receptors in gastric ulcer healing. Microsc Res Tech 2001, 53, 360-371.
6. Suzuki N.: Relationship between vascular endothelial growth factor and angiogenesis in spontaneous and indomethacin-delayed healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats. J. Physiol. Pharmacol., 1998, 49, 515-527.
7. Reut N.J.: The magnetobarotherapy of peptic ulcer. Klin. Med., 1990, 68, 81-82.
8. Kasprzak W.P., et al.: Wpływ pulsującego pola magnetycznego na szybkość gojenia niszy wrzodowej opuszki dwunastnicy. Balneol. Pol, 1992, 34, 58-67.
9. Gusiewa N.G., Szełygina N.M.: Primienienije magnitotierapii w kompleksnom leczenii bolnych jazwiennoj boleznju. Vrac Delo, 1979, 7, 5-8.
10. Sieroń A., Cieślar G.: Zastosowanie zmiennych pól magnetycznych w medycynie – 15-letnie badania własne. Wiad. Lek., 2003, 56, 9-10.
11. Kozubski F.: Obliczanie powierzchni sposobem mechanicznycm. W: Kozubksi F. (Red.): Miernictwo górnicze. Wydawnictwo Śląsk, Katowice 1972, 235-238.
12. Konturek P.C., et al.: Activation of genes for growgh factors and cyclooxygenasis in rat gastric mucosa during recovery from stress damage. Europ. J. Pharmacol., 1998, 342, 55-65.
13. Kwiecień S., et al: Effect of reactive oxygen species action on gastric mucosa in various models of mucosal injury. J. Physiol. Pharm., 2002, 53, 1, 39-50.
14. Akimoto M., et al: Roles of angiogenic factors and endothelin-1 in gastric ulcer healing. Clin. Sci. Lond., 2002, 103, suppl.48, 450-454.
