© Borgis - Postępy Fitoterapii 3/2010, s. 152-156
*Bogdan Kędzia, Elżbieta Hołderna-Kędzia
Dekontaminacja mikrobiologiczna pyłku kwiatowego przy użyciu energii jonizującej**
The microbiological decontamination of pollen by using of ionizing radiation
Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich w Poznaniu
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. Grzegorz Spychalski
Summary
The studies included 5 samples of pollen. For the decontamination was used a linear accelerator producing a free electrons flux. The samples of pollen were irradiated with a dose 10 kGy. This process reduced the amount of microorganisms at the average from 34 600 to 26 in 1 g – it is about 99.925%. The antibiotic activity and contents of biological active compounds such flavonoids and fatty acids including NNKT were not affected by parameters of ionizing radiation. The conducted studies show that the decontamination of pollen by using of ionizing energy let obtain a product with a high microbiological purity and unchanged biological activity.
Pyłkiem kwiatowym, jako jednym z produktów pszczelich, nazywany jest pyłek zbierany przez pszczoły z pylników kwiatów i przenoszony przez nie w postaci obnóży do ula.
Źródłem zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami są z jednej strony ziarna pyłku, a z drugiej strony wydzielina z przewodu pokarmowego pszczół, która używana jest do formowania obnóża.
W materiale roślinnym występują liczne bakterie saprofityczne (1), głównie ziarniaki Gram-dodatnie z rodzajów Enterococcus i Micrococcus, pałeczki Gram--ujemne fermentujące z rodzajów Enterobacter, Serratia, Hafnia, Cedacea i Erwinia oraz niefermentujące z rodzajów Pseudomonas, Flavobacterium, Acinetobacter, Alcaligenes i Aerobacter, laseczki tlenowe z rodzaju Bacillus i beztlenowe z rodzaju Clostridium i grzyby pleśniowe z rodzajów Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Fusarium, Alternaria, Cladosporium i Trichothecium oraz grzyby drożdżoidalne z rodzajów Rhodotorula i Geotrichum. Występowanie wymienionych drobnoustrojów w pyłku kwiatowym potwierdzają liczne publikacje (2-4).
Z kolei flora jelitowa zdrowej pszczoły (5) jest zdominowana przez bakterie Gram-ujemne, głównie z rodziny Enterobacteriaceae, które stanowią ok. 70% całej populacji drobnoustrojów. Około 25% przypada na laseczki Gram-dodatnie z rodzaju Bacillus i pałeczki Gram-dodatnie z rodzaju Lactobacillus. Wśród pozostałych drobnoustrojów występują m.in. grzyby drożdżoidalne.
Ponadto w pyłku kwiatowym mogą znaleźć się także przetrwalniki chorobotwórczych dla pszczół laseczek tlenowych Paenibacillus larvae (dawniej Bacillus larvae) – powodujące zgnilca złośliwego czerwiu pszczół, i Bacillus alvei – powodujące kiślicę pszczół, jak również zarodniki grzybów pleśniowych Ascosfera apis – będące przyczyną grzybicy otorbielakowej pszczół (6).
Krajowe wymagania mikrobiologiczne dla pyłku kwiatowego zostały sprecyzowane w 2003 r. (7). Zostały one przedstawione w tabeli 1.
Tabela 1. Krajowe wymagania mikrobiologiczne dla pyłku kwiatowego (wg 7).
| Drobnoustroje | Dopuszczalna liczba lub obecność |
Drobnoustroje tlenowe mezofilne (1 g)
Grzyby pleśniowe i drożdżoidalne (1 g)
Bakterie z grupy coli (0,1 g)
Salmonella (25 g)
Staphylococcus aureus (1 g)
Bacillus cereus (1 g) |
< 10,00
< 500
0
0
< 10
< 10
|
Z przeglądu dostępnych materiałów wynika, że stopień zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami w świetle wymagań krajowych jest stosunkowo wysoki. Z badań Serra-Bonvechi i Escola-Jorda (3) wynika, że liczba próbek pyłku kwiatowego nieodpowiadająca tym wymaganiom wynosi 95%, z badań Kędzi i Hołdernej-Kędzi (8) wynika, że takich próbek jest 44,4%, natomiast badania Gonzalesa i wsp. (4) wskazują, że liczba próbek pyłku kwiatowego nieodpowiadających wymaganiom mikrobiologicznym (grzyby pleśniowe i drożdżoidalne) wynosi 71,4%. Wyniki przytoczonych badań zebrano w tabeli 2.
Tabela 2. Stopień zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami w świetle wymagań krajowych (wg 3, 4 i 8).
| Drobnoustroje | Serra-Bonvechi i Escola-Jorda (3) | Kędzia i Hołderna-Kędzia (8) | Gonzalez i wsp. (4) |
| (n=20) | (n=18) | (n=7) |
Drobnoustroje tlenowe (1 g)
Grzyby (1 g)
Bakterie coli (0,1 g)
Salmonella (25 g)
S. aureus
(1 g)
B. cereus (1 g) | 1*
19
11
| 3
5
6
0
0
1 |
5
|
| Liczba próbek pyłku kwiatowego nieodpowiadających wymaganiom | 19/20 | 8/18 | 5/7 |
| (95%) | (44,4%) | (71,4%) |
| *Liczba próbek nieodpowiadających wymaganiom |
Na podstawie przedstawionych powyżej wyników można przyjąć, że dla uzyskania próbek pyłku kwiatowego o czystości mikrobiologicznej odpowiadającej wymaganiom normatywnym, należy w większości przypadków dokonywać dekontaminacji mikrobiologicznej.
Celem podjętych badań była próba otrzymania pyłku kwiatowego o wysokiej czystości mikrobiologicznej oraz niezmienionej aktywności antybiotycznej i zawartości głównych składników biologicznie aktywnych.
Materiał i metody
Badane próbki
Pochodzenie i rok pozyskania próbek pyłku kwiatowego podano w tabeli 3. Badania próbek przeprowadzono w latach 1999-2000.
Tabela 3. Pochodzenie i rok pozyskania próbek pyłku kwiatowego użytych w badaniach.
| Numer próbki | Pochodzenie | Rok pozyskania próbki |
|
1
2
3
4
5
| Bartpol s.c., Poznań
Okręgowa Spółdzielania Pszczelarska, Poznań
Pasieka Specjalistyczna J. Ślachetka, Poznań
Sądecki Bartnik, Stróże
Apipol-Farma, Sp. z o.o., Myślenice |
1997
1999
1999
1999
1998
|
Proces dekontaminacji
Badania prowadzono w Stacji Radiacyjnego Utrwalania Płodów Rolnych we Włochach pod Warszawą. Próbki pyłku kwiatowego umieszczano w torebkach z folii polietylenowej w warstwie o grubości 1 cm. Próbki pyłku kwiatowego poddawano działaniu strumienia elektronów wytwarzanego przez akcelerator liniowy Pilot produkcji rosyjskiej. Energia elektronów (e–) wynosiła 8-10 MeV przy średniej mocy wiązki 1 kW. Zastosowano dawkę napromieniowania w wysokości 10 kGy.
Badania mikrobiologiczne
Badania dotyczące jakości mikrobiologicznej pyłku kwiatowego prowadzono według metodyki opracowanej przez Kędzię (1). Obejmowały one określanie ogólnej liczby drobnoustrojów tlenowych mezofilnych i grzybów pleśniowych i drożdżoidalnych oraz wykrywanie obecności bakterii z grupy coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus i bakterii beztlenowych Clostridium.
Oznaczanie aktywności antybiotycznej pyłku kwiatowego wykonywano w 10% wyciągach etanolowych sporządzonych z tego surowca. Próbki pyłku kwiatowego ekstrahowano 70% etanolem w stosunku 1:10 w warunkach pokojowych przez 3 dni, a następnie uzyskane wyciągi zagęszczano do objętości 65% suchej masy w wyparce próżniowej w temp. nie przekraczającej 40°C. Aktywność antybiotyczną oznaczano wcześniej opracowaną metodą z użyciem szczepu standardowego Staphylococcus aureus ATCC 6538P (9). Aktywność wyrażano w U/g zagęszczonego wyciągu.
Oznaczenia chemiczne
Zawartość flawonoidów oznaczano w zagęszczonych wyciągach etanolowych z pyłku kwiatowego metodą spektrofotometryczną podaną przez FP VI (10). Wyniki badań przeliczano na kwercetynę.
Zawartość kwasów tłuszczowych we frakcji lipidowej pyłku kwiatowego oznaczano według Metcalfa i wsp. (11). Frakcję lipidową ekstrahowano z próbek pyłku za pomocą mieszaniny chloroformu i metanolu (2:1). Następnie kwasy tłuszczowe estryfikowano mieszaniną BF3 w metanolu i estry metylowe kwasów po hydrolizie 0,5 n NaOH analizowano za pomocą chromatografii gazowej.
Wyniki i dyskusja
Wyniki badań przedstawione w tabeli 4 wskazują, że napromieniowanie próbek pyłku kwiatowego energią jonizującą w dawce 10 kGy obniża liczbę bakterii tlenowych średnio z 34.600 do 26 w 1 g, tj. o 99,925%. Z teoretycznego punktu widzenia można przyjąć, że na 1.000.000 drobnoustrojów przed dekontaminacją mikrobiologiczną po przeprowadzeniu tego procesu pozostaje w pyłku kwiatowym zaledwie 750 drobnoustrojów. Podobnie sytuacja kształtowała się w przypadku grzybów. Po procesie dekontaminacji ich liczba w pyłku kwiatowym obniżyła się średnio z 2.200 do 5 w 1 g (o 99,773%). Po dekontaminacji w pyłku kwiatowym nie stwierdzono ponadto bakterii z grupy coli oraz bakterii beztlenowych Clostridium. Wskazuje to na wysoką sprawność procesu dekontaminacji i możliwość uzyskiwania dzięki niej wysokiej czystości mikrobiologicznej pyłku kwiatowego, który po tym procesie odpowiadał we wszystkich przypadkach krajowym wymaganiom mikrobiologicznym.
Tabela 4. Wpływ procesu dekontaminacji mikrobiologicznej na stopień zanieczyszczenia pyłku kwiatowego drobnoustrojami.
| Drobnoustroje | Liczba lub obecność drobnoustrojów w próbce |
| przed dekontaminacją | po dekontaminacji |
Bakterie tlenowe mezofilne (1 g)
Grzyby pleśniowe i drożdżoidalne (1 g)
Bakterie z grupy coli (0,1 g)
Salmonella (25 g)
Staphylococcus aureus (1 g)
Bacillus cereus
Bakterie beztlenowe
Clostridium (0,1 g) | 34.600*
2.200
6
0/5
< 10
< 10
3/5 | 26
5
0
0/5
< 10
< 10
0/5 |
| *Średnia z 5 próbek |
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Kędzia B. Badania nad zanieczyszczeniem surowców zielarskich drobnoustrojami. Rozprawa habilitacyjna. Wyd. IRiPZ, Poznań 1999; 44-50. 2. Makowicz J. Pierzga i pyłek kwiatowy. Wyd. Wyższej Szkoły Pedagogicznej, Kielce 1985; 22-5. 3. Serra-Bonvechi J, Escola-Jorda. Nutrient composition and microbiological quality of honeybee collected pollen in Spain. J Agric Food Chem 1997; 45:725-32. 4. Gonzalez G, Hinojo MJ, Matco R i wsp. Occurrence of mycotoxin producing fungi in bee pollen. Int J Food Microbiol 2005; 105:1-9. 5. Gliński Z, Jarosz J. Mikroflora pszczoły miodnej. Post Mikrobiol 1988, 27:95-107. 6. Kostecki R, Tomaszewska B. Choroby i szkodniki pszczół. PWRiL. Warszawa 1987. 7. Dziennik Ustaw Nr 37 z dn. 13 stycznia 2003, poz. 326. Rozporządzenie w sprawie maksymalnych poziomów zanieczyszczeń chemicznych i biologicznych w żywności. 8. Hołderna-Kędzia E, Kędzia B. Badania w ramach tematu 125 – Badania dla zleceniodawców zewnętrznych. Inst. Włókien Nat i Rośl Ziel, Poznań 2000-2010. Dane nieopublikowane. 9. Hołderna-Kędzia E, Kędzia B, Mścisz A. Poszukiwanie wyciągów roślinnych o wysokiej aktywności antybiotycznej. Post Fitoter 2009; (1):3-11. 10. Farmakopea Polska VI. Oznaczanie zawartości flawonoidów. Wyd Min Zdr, Warszawa 2002; 150. 11. Metcalf LD, Schmitz AA, Pelka JR. Rapid preparation of fatty acid esters from lipids for gas chromatographic analysis. Anal Chem 1966; 38:514-5. 12. Joern KE. Sterilization of plant materials such as pollen or seeds. Ger Offen DE 3, 541, 706. Med Arom Plants Abstr 1992; 14(2):216. 13. Yook H-S, Lim S-I, Byun M-W. Changes in microbiological and physicochemical properties of bee pollen by application of gamma irradiation and ozone treatment. J Food Prot 1998: 61(2):217-220.
