Ostra białaczka szpikowa (OBSz) jest chorobą rozrostową układu krwiotwórczego, w której dochodzi do klonalnej proliferacji i gromadzenia się w organizmie niedojrzałych morfologicznie i czynnościowo komórek blastycznych, wywodzących się z prekursorowej, stransformowanej nowotworowo komórki hematopoetycznej. Komórki białaczkowe naciekając szpik kostny wypierają prawidłowe linie komórkowe, co powoduje u większości chorych pojawienie się niedokrwistości, małopłytkowości i neutropenii. Mogą również tworzyć infiltraty w różnych narządach, co przyczynia się do bogatej i zróżnicowanej symptomatologii OBSz (1). W Europie częstość występowania i częstość zgonów na OBSz są oceniane odpowiednio na 5-8 i 4-6/100 000 mieszkańców/rok (2). Wśród chorych przeważają mężczyźni (3:2). Zachorowalność na ostre białaczki szpikowe znacznie wzrasta z wiekiem, szczególnie po 70. roku życia. Klasyfikacja OBSz zaproponowana w 2008 roku przez Światową Organizację Zdrowia (World Health Organization – WHO) wyodrębnia rożne pod względem biologicznym jednostki w oparciu o cechy kliniczne, morfologiczne, immunofenotypowe, a także obecność nieprawidłowości cytogenetycznych i molekularnych (tab. 1). W przeciwieństwie do poprzednio stosowanej klasyfikacji FAB (French-American-British), podział WHO w ograniczonym stopniu opiera się na wynikach badań cytochemicznych (3).

W rozwoju OBSz istotną rolę odgrywają czynniki dziedziczne, promieniowanie jonizujące, narażenie zawodowe, głównie na środki chemiczne, jak również leki. Częstsze występowanie OBSz obserwuje się w niektórych zespołach chorobowych z aneuploidią chromosomów somatycznych, np. w zespole Downa (trisomia 21) oraz chorobach dziedzicznych związanych z defektem naprawy DNA, takich jak niedokrwistość Fanconiego, zespół Blooma, zespół Schwachmana i Diamonda, zespół ataksja-teleangiektazja. W ostrą białaczkę szpikową może ewoluować zespół Kostmanna, u podłoża którego występuje mutacja genu receptora dla granulocytarnego czynnika wzrostu (G-CSF) oraz elastazy neutrofilowej, jak również inne klonalne choroby układu krwiotwórczego, takie jak zespoły mieloproliferacyjne oraz mielodysplastyczne. Do czynników środowiskowych o udowodnionym związku z rozwojem OBSz należy również ekspozycja na promieniowanie jonizujące, benzen oraz przebyta chemioterapia z użyciem leków alkilujących i inhibitorów topoizomerazy II.

Rozwój OBSz związany jest z nagromadzeniem nabytych zaburzeń genetycznych oraz zmian epigenetycznych (modyfikacja ekspresji genów bez zmian w sekwencji DNA) w komórkach krwiotwórczych, co prowadzi do nieprawidłowości w zakresie mechanizmów ich proliferacji i różnicowania się. Zgodnie z obowiązującą aktualnie teorią „dwóch uderzeń” uważa się, że do powstania transformacji białaczkowej niezbędne jest współistnienie mutacji aktywującej szlaki przekazywania sygnału i w konsekwencji stymulującej proliferację i/lub przeżycie białaczkowej komórki prekursorowej oraz aberracji genetycznej modulującej funkcje czynników transkrypcyjnych lub ich koaktywatorów, odpowiedzialnej za zahamowanie dojrzewania komórek progenitorowych (4, 5, 6)

Mutacje genów odpowiedzialne za proces leukemogenezy możemy podzielić na: 1) aktywujące proliferację, 2) wpływające na proces transkrypcji oraz na 3) oddziałujące na cykl komórkowy i apoptozę komórek białaczkowych.

Do pierwszej grupy zalicza się mutacje genu FLT3 (FMS-like tyrosine kinase) kodującego białko należące do III klasy receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej. Ekspresję genu FLT3 stwierdza się w prawidłowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (7, 8).

Mutacje te mają charakter wewnętrznej tandemowej duplikacji (FLT3 – internal tandem duplication, FLT-3 ITD), bądź duplikacji domeny dla kinazy tyrozynowej FLT3 (FLT3-TKD). Mutacja FLT3-ITD opisana została po raz pierwszy przez Nakao i wsp. w 1996 roku i występuje u około 25-35% dorosłych chorych na OBSz, natomiast mutacja FLT3-TKD u ok. 7-8% pacjentów (9, 10, 11).

Zmiany konformacyjne domeny kinazy w wyniku duplikacji powodują autofosforylację i aktywację receptora bez udziału ligandu. Ciągła aktywacja FLT3 i kaskady docelowych kinaz PI-3/AKT/RAS/MAPK i STAT5, prowadzi do zwiększenia siły sygnałów antyapoptycznych i w konsekwencji do autonomicznej proliferacji komórek (4).

Do grupy mutacji stymulujących proliferację komórkową zalicza się również mutacje genu RAS (Ras viral oncogene homolog gene) odgrywającego rolę w regulacji cyklu komórkowego i różnicowania poprzez białka RAS. Mutacje dotyczą białek NRAS, KRAS i HRAS i są wykrywane w ok. 5-15% OBSz (12).

Zmiany biomolekularne wpływające na procesy transkrypcji powstają w wyniku aberracji chromosomalnych, takich jak t(8;21), inv(16)/t(16;16), t(15;17) oraz nieprawidłowości 11q23. Zaburzenia na poziomie molekularnym dotyczą rearanżacji genów kodujących podjednostki alfa lub beta CBF (tzw. core binding factor), czynnika transkrypcyjnego odpowiedzialnego za procesy różnicowania się komórek. W przypadku t(8;21) gen RUNX1 (runt-related transcription factor 1) kodujący podjednostkę alfa CBF ulega fuzji z genem RUNX1T1 natomiast w przypadku inv(16)/t(16;16) gen CBFB kodujący podjednostkę beta tworzy fuzję z genem MYH11. Białka kodowane przez powstałe w ten sposób geny fuzyjne działają jak inhibitory dojrzewania komórek hematopoetycznych (13, 14, 15).

Translokacja t(15;17) prowadzi do powstania genu fuzyjnego PML/RARalfa, który koduje chimeryczne białko białaczki promielocytowej (PML)/receptora α kwasu retynoinowego (RARα). Gen RARα koduje receptor dla hormonu jądrowego należącego do rodziny czynników transkrypcyjnych. Po związaniu kwasu retynoinowego, RARα pobudza ekspresję wielu genów. Translokacja 15;17 zestawia geny PML i RARα w konfiguracji podlegającej transkrypcyjnej kontroli onkogenu PML. Białko PML/RARα hamuje transkrypcję i blokuje różnicowanie komórkowe (16).

Rearanżacje genu MLL (mixed-lineage leukemia) z różnymi partnerami genowymi powstałe w wyniku translokacji t(v;11q23), prowadzą do zaburzenia prawidłowej funkcji genu w procesie transkrypcji oraz ekspresji genów HOX (Homeobox genes) kluczowych dla prawidłowej proliferacji oraz różnicowania macierzystych i progenitorowych komórek hematopoetycznych (17, 18).

Najczęstszą mutacją genu MLL jest częściowa tandemowa duplikacja (MLL-PTD), polegająca na wewnątrzgenowej duplikacji eksonów 2-6 lub 2-8. MLL-PTD stwierdza się u około 5-10% dorosłych chorych na OBSz z prawidłowym kariotypem.

Na proces transkrypcji mogą też wpływać mutacje genów kodujących białka transkrypcyjne, takich jak CEBPA (CCAAT enhancer binding factor alpha) i RUNX1 (19, 20, 21).

Trzecią grupę stanowią mutacje genów kontrolujących cykl komórkowy i apoptozę: mutacje NPM1 (nukleofosmina 1, jądrowa fosfoproteina B23, numatryna) i delecje genu TP53 (kodującego białko p53). NPM1 jest nukleoplazmatycznym białkiem, głównie zlokalizowanym w jąderku, krążącym między jądrem a cytoplazmą i posiadającym wielorakie funkcje. Białko to oddziaływuje z p53 w nadzorowaniu proliferacji i apoptozy komórek, zapewnia stabilność genomu kontrolując naprawę DNA oraz duplikacje centrosomów w czasie mitozy, jak również odgrywa kluczową rolę w biogenezie rybosomów. Gen NPM1 funkcjonuje zarówno jako onkogen, jak i gen supresorowy w zależności od poziomu ekspresji genu, interakcji z partnerami i kompartmentalizacji.

Mutacje NMP1 należą do najczęstszych dysfunkcji genetycznych w OBSz, występując u 50-60% pacjentów z OBSz o prawidłowym kariotypie (22, 23).

Delecje genu TP53 zlokalizowanego w obrębie fragmentu 17p, występują u 10% chorych na OBSz, częściej stwierdza się je w białaczkach wtórnych do chemio- i radioterapii oraz w przypadku kariotypu złożonego (24).

Rozpoznanie OBSz ustala się na podstawie cytomorfologicznej oceny treści szpikowej pobranej drogą biopsji aspiracyjnej. Ocena wycinka kostnego (trepanobiopsja szpiku) jest badaniem opcjonalnym i zaleca się jej wykonanie w przypadku braku możliwości uzyskania adekwatnego materiału do badania w biopsji aspiracyjnej np., w tzw. „punkcji suchej”.

Preparaty szpiku i krwi obwodowej po zabarwieniu metodą Maya-Grűnwalda-Giemsy lub Wrighta-Giemsy poddawane są ocenie morfologicznej. Zaleca się ocenę morfologiczną co najmniej 200 leukocytów w rozmazie krwi obwodowej i co najmniej 500 krwinek jądrzastych w preparatach szpiku kostnego w obrębie rozmazów jego grudek. Do rozpoznania OBSz niezbędne jest stwierdzenie co najmniej 20% komórek blastycznych w szpiku lub krwi obwodowej, przy czym mieloblasty, monoblasty, promonocyty i megakarioblasty zaliczne są do puli komórek blastycznych. Wyjątkiem są białaczki z powtarzalnymi aberracjami cytogenetycznymi: t(8;21), inv(16), t(16; 16) lub t(15; 17), w których stwierdzenie ww. nieprawidłowości chromosomalnych jest wystarczające do postawienia rozpoznania, niezależnie od liczby blastów w szpiku i/lub krwi. Stosowane przez wiele lat rutynowo barwienia cytoenzymatyczne (reakcja peroksydazowa, esterazowa, wykrywanie ciał tłuszczowych z użyciem Sudanu czarnego B, bądź glikogenu w metodzie PAS) w celu dokładniejszego ustalenia podtypu morfologicznego OBSz, są obecnie zastępowane badaniami immunofenotypowymi za pomocą wielokolorowej cytofluorymetrii (25).

Ocena ekspresji szerokiego zestawu antygenów jest konieczna do potwierdzenia rozpoznania OBSz, a także do prawidłowego rozróżnienia danego typu rozrostu.

Za obecność danego antygenu w OBSz przyjmuje się jego ekspresję na co najmniej 20% komórek białaczkowych, z wyjątkiem markerów CD3cyt, MPO, TdT, CD34, CD117, dla których niższy poziom ekspresji (≥ 10% komórek białaczkowych) jest wystarczający dla stwierdzenia ich obecności w OBSz (25).

Minimalny panel markerów cytoplazmatycznych i powierzchniowych niezbędnych do diagnostyki OBSz i białaczek o mieszanym fenotypie przedstawiono w tabeli 2. Cytometria przepływowa wykorzystywana jest również do oceny minimalnej choroby resztkowej (minimal residual disease – MRD) w oparciu o zestaw antygenów charakteryzujących dany klon białaczkowy tzw. LAIP (leukemia associated immunophenotype), dobieranych indywidualnie dla każdego chorego. Wykorzystanie jednoczesnej oceny czterech lub więcej antygenów w cytofluorymetrii pozwala na uzyskanie czułości badania MRD na poziomie 10^–3-10^–6 komórek jądrzastych szpiku (25).

Analizy aberracji genetycznych klonu białaczkowego dokonuje się za pomocą klasycznej cytogenetyki, oceny metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in-situ (FISH) lub przy użyciu metod molekularnych, głównie z wykorzystaniem techniki polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) (25).

Cytogenetyka: Anomalie cytogenetyczne stwierdza się u około 55% chorych, a kariotyp klonu białaczkowego w chwili rozpoznania jest najsilniejszym czynnikiem prognostycznym w OBSz.

Konwencjonalna analiza cytogenetyczna tzw. metoda prążkowa jest niezbędnym elementem dla diagnostyki OBSz i podstawą aktualnej klasyfikacji WHO 2008. Ogólnie przyjętą zasadą jest ocena co najmniej 20 metafaz z hodowli komórek szpiku kostnego. Obecność jednej z siedmiu aberracji cytogenetycznych (t(8;21), inv(16) lub t(16;16), t(15;17), t(9;11), t(6;9), inv(3) lub t(3;3) t(1;22)) warunkuje rozpoznanie kategorii białaczek wg klasyfikacji WHO: OBSz z powtarzalnymi aberracjami genetycznymi. Wykrycie szeregu innych zaburzeń cytogenetycznych jest wystarczające do rozpoznania OBSz z cechami zależnymi od MDS. Do anomalii tych zalicza się: