© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 10/2011, s. 831-835
*Anna Zabost, Zofia Zwolska, Ewa Augustynowicz-Kopeć
Genotyp i fenotyp acetylacji u chorych na gruźlicę1)
Genotype and phenotype of acetylation in tuberculosis patients
Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy Chorób Płuc w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. nadzw. dr hab. Ewa Augustynowicz-Kopeć
Streszczenie
Izoniazyd (INH) jest jednym z głównych leków przeciwprątkowych. W wątrobie człowieka ulega procesowi acetylacji przy udziale enzymu N-acetylotransferazy. Szybkość acetylacji jest cechą zdeterminowaną genetycznie i jest ona stała u każdego człowieka, ale różna u różnych chorych. Ze względu na szybkość przebiegu reakcji acetylacji w populacji ludzkiej wyróżnia się dwie fenotypowe grupy: szybkich i wolnych acetylatorów. Enzym kodowany przez NAT2 wykazuje polimorfizm, który jest wynikiem punktowych mutacji. Aktywność N-acetylotransferazy 2 jest uwarunkowana kombinacjami 53 różnych alleli, zawierających od jednej do czterech zmian w sekwencji nukleotydowej.
Cel pracy. Celem było zbadanie związku pomiędzy genotypem NAT2 a fenotypem acetylacji izoniazydu.
Materiał i metody. Próbki krwi zostały pobrane od 64 pacjentów przed (czas 0) podaniem leku oraz 1, 3, 6 godzin po podaniu leku. Stężenia INH określano przy użyciu metody chromatograficznej. Genomowe DNA izolowano przy użyciu kitu Blood DNA Kit firmy Qiagen i poddano reakcji amplifikacji ze starterami: NAT1 i NAT2. Uzyskane produkty reakcji poddano działaniu restryktaz (Kpn1, Dde1, Tag1, BamH1). Obecność dwóch zmutowanych alleli określała wolny typ acetylacji, natomiast szybki acetylator posiadał jeden lub dwa allele dzikie NAT2*4.
Wyniki. W badanej grupie chorych na gruźlicę zidentyfikowano 30 szybkich i 34 wolnych acetylatorów. Średnie stężenie izoniazydu w surowicy u 30 szybkich acetylatorów wynosiło w 3 h 1,4 μg/ml, natomiast u 34 wolnych acetylatorów 4,91 μg/ml. Stężenia INH obserwowane u szybkich acetylatorów były znacznie niższe niż u osób z wolnym typem acetylacji (p < 0,01). W badanej grupie chorych zidentyfikowano 9 różnych genotypów N-acetylotransferazy 2. Wśród chorych z szybkim typem acetylacji dominował genotyp NAT2*4/5, u wolnych acetylatorów NAT2*5/6.
Wnioski. Oznaczanie mutacji w genie NAT2 umożliwia szybką identyfikację typu acetylacji INH i jest zgodne z typem acetylacji określonym na podstawie kryteriów stosowanych w określaniu biodostępności leku.
Summary
Isoniazid (INH), an important agent in the treatment of tuberculosis. The major pathway for INH metabolism is acetylation by a no inducible hepatic and intestinal enzyme, N-acetyltransferase (NAT). The rate of acetylation is genetically determined and is constant in any individual but varies in different patients. According to speed of acetylation human population are divided on two different phenotypic groups: slow and fast acetylators. N-acetyltransferase 2 (NAT2) exhibits polymorphisms, which are the result of point mutations. There are 53 know alleles, and each allelic variant is a combination of one, two, three, or four nucleotide substitutions.
Aim of study. The aim was investigate the relationship between the NAT2 genotype and acetylator phenotype of INH.
Material and methods. Blood samples were taken from 64 patients before (time 0) and 1, 3, 6 hrs after drug administration. Plasma concentrations of INH were determined with chromatography method. Genomic DNA was extracted by Blood DNA kit and amplified by PCR with two primers: NAT1 and NAT2. After amplification, the PCR product was cut separately with 4 different restriction enzymes: Kpn1, Dde1, Tag1, and BamH1. The presence of any 2 mutant alleles defines the slow-acetylator genotype, whereas the rapid acetylators have 1 or 2 wild-type NAT2*4 alleles.
Results. In the group of tuberculosis patients were 30 fast acetylators and 34 patients with slow type of acetylation. INH mean plasma concentration of 30 fast acetylators in 3 h were 1,4 μg/ml, whereas of 34 slow acetylator 4,91 μg/ml. For all treated patients concentrations of INH observed in the fast acetylators were considerably lower than those found in the slow acetylators (p < 0.01). In the tested group were 9 different NAT2 genotypes. Among patients with fast type of acetylation predominated genotype NAT2*4/5; in group of slow acetylators NAT2*5/6.
Conclusions. Determination of mutation in NAT2 gene enabled identification of type of INH acetylation and was consistent with type determined on base of criteria used in defining bioavailability of the drug.
Wstęp
W hierarchii leków przeciwgruźliczych izoniazyd (INH) obok ryfampicyny (RMP) zajmuje najważniejszą pozycję. Szerokie spektrum działania, dobra biologiczna dostępność, umiarkowane działania niepożądane, przenikanie do komórek żernych i niski koszt sprawiają, że izoniazyd stanowi nieomal idealny lek przeciwprątkowy. Wadą leku jest stosunkowo duża częstość spontanicznie rozwijającej się oporności u prątków 105-107 co wyklucza jego stosowanie w monoterapii (1).
Skuteczność i bezpieczeństwo stosowania INH w gruźlicy mogą być zakłócone (jak wykazują badania in vitro) łatwym nabywaniem oporności przez prątki pod wpływem kontaktu z lekiem, w tym szczególnie z dawkami suboptymalnymi.
Zjawisko acetylacji INH było znane od dawna i intensywnie badane już w pierwszych latach stosowania leku w leczeniu gruźlicy zarówno w aspekcie praktycznym, jak i poznawczym. Badania przeprowadzone w latach 60. przez Evans’a nad acetylacją izoniazydu wykazały bimodalny rozkład populacji jak również to, że szybkość acetylacji izoniazydu jest cechą dziedziczną (2).
Z organizmu człowieka izoniazyd eliminowany jest w postaci zmetabolizowanej, a szybkość tego procesu zależy od aktywności enzymu N-acetylotransferazy (NAT) wyizolowanej po raz pierwszy przez John Jenne w 1956 roku (3). N-acetylotransferazy katalizują przeniesienie grupy acetylowej z acetylokoenzymu A do terminalnej grupy aminowej aryloamin, arylohydrazyn i niektórych amin heterocyklicznych. Reakcji acetylacji podlegają leki, jak również znane środowiskowe kancerogeny.
U ludzi reakcje acetylacji katalizowane są przez dwie cytoplazmatyczne N-acetylotransferazy, typu 1 i typu 2, kodowane odpowiednio przez gen NAT1 i NAT2 (4). Geny kodujące oba enzymy zostały po raz pierwszy wyizolowane w 1989 roku przez Grant’a (5).
Badania molekularne wykazały, że produkty genów NAT1 i NAT2 posiadają katalityczną specyficzność do substratów. Obserwowane różnice w tempie metabolizowania substancji zależnych od N-acetylotransferazy 2 (NAT2) zostały powiązane z obecnością polimorfizmu genetycznego. Pierwsze badania przeprowadzone przez Deguchi’ego w 1990 roku zidentyfikowały w obrębie genu trzy mutacje C481T (allel NAT2*5), G590A (allel NAT2*6) i G857A (allel NAT2*7), odpowiedzialne za wolny typ acetylacji (6).
Do chwili obecnej zidentyfikowano 53 allele, które zostały zarejestrowane na stronie internetowej (http://louisville.edu/medschool/pharmacology/NAT.HTML). Każdy z wariantu allelu genu NAT2 zawiera od jednej do czterech substytucji nukleotydowych, występujących w pozycjach 111, 190, 191, 282, 341, 364, 411, 434, 481, 499, 590, 759, 803, 845, 857 i 859 (7, 8).
W zależności od szybkości acetylacji INH wyróżnia się w populacji ludzkiej dwie fenotypowo odmienne grupy, szybkich i wolnych acetylatorów; osiągających po jednakowej dawce różne stężenia leku w surowicy i różną kinetykę wchłaniania i wydalania leku (9). Ludzie określani fenotypowo jako szybcy acetylatorzy mają jeden lub dwa allele genu NAT2 kodujące enzym o wysokiej aktywności. Dominujący allel NAT2*4 warunkuje pełną aktywność enzymu. Wolni acetylatorzy mają dwa allele kodujące białko o obniżonej aktywności (1).
Cel pracy
Celem pracy było zbadanie korelacji pomiędzy określaniem typu acetylacji metodą fenotypową i genotypową.
Materiał i metody
Badania zostały przeprowadzone u 64 pacjentów leczonych na gruźlicę w Mazowieckim Centrum Leczenia Chorób Płuc i Gruźlicy. Krew do oznaczenia biodostępności izoniazydu została pobrana przed (czas 0) podaniem leku oraz 1, 3 i 6 godzin po podaniu leku. Jednocześnie pobierano krew do badania polimorfizmu N-acetylotransferazy 2 metodą genetyczną.
Oznaczanie biodostępności INH wykonywano metodą chromatograficzną (HPLC) według Seifart i wsp. z modyfikacją własną (1). Do określenia fenotypu acetylacji zastosowano dwa kryteria; indeks inaktywacji I3 (wartość graniczna 0,65) i stężenie resztkowe INH w surowicy po 6 godzinach C6 (wartość graniczna 0,8 μg/ml) (9).
W celu zbadania polimorfizmu genu N-acetylo-transferazy 2 izolowano genomowe DNA przy użyciu kitu Blood DNA Kit firmy Qiagen. Wyizolowane DNA poddano reakcji amplifikacji ze specyficznymi starterami według metody Spurr i wsp. z modyfikacją własną (1). Produkty reakcji poddawano działaniu 4 enzymów restrykcyjnych BamH1, Dde1, Kpn1 i Tag1 w celu wykrycia zmutowanych alleli genu NAT2. Rozdział uzyskanych produktów trawienia przeprowadzono na 2% żelu agarozowym, otrzymane prążki wizualizowano bromkiem etydyny i poddano analizie w programie LabWork v. 4.5.
Wyniki
W badanej grupie 64 chorych na gruźlicę zidentyfikowano 30 (47%) szybkich acetylatorów i 34 (53%) osoby wolno acetylujące. Szybcy acetylatorzy najwyższe stężenie leku osiągali w pierwszej godzinie od podania leku – średnio 5,35 μg/ml (zakres 0,8-9,2 μg/ml). Po 3 godzinach średnie stężenie izoniazydu wynosiło 1,71 μg/ml, a po 6 godzinach wartości stężenia leku wynosiły w granicach 0-0,8 μg/ml. W grupie wolnych acetylatorów maksymalne stężenia INH w surowicy stwierdzono również jedną godzinę od podania leku – 7,45 μg/ml (zakres: 1,8-11,4 μg/ml). Po 3 godzinach po podaniu leku wynosiło ono 4,91 μg/ml, a po 6 godzinach było w zakresie 1,2-4,3 μg/ml. Stężenia INH obserwowane u szybkich acetylatorów były znacznie niższe niż u osób z wolnym typem acetylacji (ryc. 1).
Ryc. 1. Średnie stężenia izoniazydu w surowicy u szybkich i wolnych acetylatorów.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Zabost A: Polimorfizm w genie N-acetylotransferazy 2 jako metoda wyznaczania typu acetylacji u ludzi. Praca doktorska IGiChP Warszawa 2010.
2. Evans DA, White TA: Human acetylation polymorphism. J Lab & Clin Med 1964; 63: 394-403
3. Jenne JW: Studies of human patterns of isoniazid metabolism using an intravenous fall-off technique with a chemical method. Am Rev Respir Dis 1960; 81: 1-8.
4. Hein DW: Molecular genetics and function of NAT1 and NAT2; role in aromatic amine metabolism and carcinogenesis. Mutat Res 2002; 506-507: 65-77.
5. Grant DM, Lottspeich F, Meyer UA: Evidence for two closely related isozymes of arylamine N-acetyltransferase in human liver. FEBS Lett 1989; 244: 203-207.
6. Deguchi T, Mashimo M, Suzuki T: Correlation between acetylator phenotypes and genotypes of polymorphic arylamine N-acetyltransferase in human liver. J Biol Chem 1990; 265: 12575-12760.
7. Boukouvala S, Fakis G: Arylamine N-acetyltransferases: what we learn from genes and genomes. Drug Metab Rev 2005; 37: 511-564.
8. Cascorbi I, Brockmöller J, Mrozikiewicz PM et al.: Arylamine N-acetyltransferase activity in man. Drug Metab Rev 1999; 31: 489-502.
9. Augustynowicz-Kopeć E, Zwolska Z: Typ acetylacji izoniazydu (INH) u chorych na gruźlicę leczonych w IGiChP w Warszawie w latach 1990-1997. Analiza wskaźników biologicznej dostępności i acetylacji INH u szybkich i wolnych acetylatorów. Pneum i Alerg Polska 2002; 70, 3-4, 180-192.
10. Zent C, Smith P: Study of the effect of concomitant food on the bioavailability of rifampicin, isoniazid and pyrazinamide. Tuber Lung Dis 1995; 76: 109-113.
11. Skrętkowicz J, Sękulska M, Podlaszczuk M, Polakowski P: Fenotyp acetylacji u osób uzależnionych od alkoholu w okresie abstynencji. Probl Ter Monit 1995; 6: 173-176.
12. Chlebowska I, Beszłej JA, Grzesiak M et al.: Research of acetylation phenotype in dependent on alcohol people. Adv Clin Exp Med 2006; 15: 47-52.
13. Huang YS, Chern HD, Su WJ et al.: Polymorphism of the N-acetyltransferase 2 gene as a susceptibility risk factor for antituberculosis drug-induced hepatitis. Hepatology 2002; 35: 883-889.
14. Zwolska Z, Niemirowska-Mikulska H, Augustynowicz-Kopeć E: Wyniki badania u zdrowych ochotników biodostępności ryfampicyny i izoniazydu z polskiej kapsułki dwulekowej do leczenia gruźlicy Rifamazid. Pneu Alerg Pol 1998; 66: 198-206.
15. Kinzing-Schippers M, Tomalik-Scharte D, Jetter A et al.: Should we use N-acetyltransferase type 2 genotyping to personalize isoniazid doses? Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 1733-1738.
16. Sim E, Payton M, Noble M, Minchin R: An update of genetic, structural and functional studies of arylamine N-acetyltransferase in eukaryotes and prokaryotes. Hum Mol Genet 2000; 9, 2435-2441.
17. Parkin DP, Vandenplas S, Botha JH et al.: Trimodality of isoniazid elimination: phenotype and genotype in patients with tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med 1997; 155: 117-1722.
18. Smith CA, Wadelius M, Gough AC et al.: A simplified assay for the arylamine N-acetyltransferase 2 polymorphism validated by phenotyping with isoniazid. J Med Genet 1997; 34: 758-760.
19. Kita W, Tanigawara Y, Chikazawa S et al.: N-acetyltransferase 2 genotype correlated with isoniazid acetylation in Japanese tuberculous patients. Biol Pharm Bull 2001; 24: 544-549.
20. Cascorbi J, Drakoulis N, Brockmőller J et al.: Arylamino N-acety-ltransferase (NAT2) mutations and their allelic linkage in unrelated Caucasian individuals: correlation with phenotypic activity. Am J Hum Genet 1995; 57: 581-592.
21. Lin HJ, Han CY, Lin BK, Hardy S: Slow acetylator mutations in the human polymorphic N-acetyltransferase gene in 786 Asian, Blacks, Hispanics, and Whites: application to metabolic epidemiology. Am J Hum Genet 1993; 52: 827-834.
22. Okumura K, Kita T, Chikazawa S et al.: Genotyping of N-acety-lation polymorphism and correlation with procainamide metabolism. Clin Pharmacol Ther 1997; 61: 509-51.
