© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 10/2011, s. 853-861
*Sylwia Budniak, Agnieszka Kędrak-Jabłońska, Monika Reksa, Anna Szczawińska, Marek Krupa
Zastosowanie metody Real-time PCR opartej na wykorzystaniu nukleolitycznych sond typu TaqMan do wykrywania markera wirulencji Bacillus anthracis – genu pag oraz specyficznej sekwencji chromosomalnej rpoB
Application of the Real-time PCR method with TaqMan probes for the detection of Bacillus anthracis virulence marker – gene pag and specific chromosomal sequence rpoB
Zakład Mikrobiologii Państwowego Instytutu Weterynaryjnego – Państwowego Instytutu Badawczego
Kierownik Zakładu: prof. nadzw. dr hab. Krzysztof Szulowski
Streszczenie
Przedmiotem pracy było zastosowanie metody Real-time PCR opartej na wykorzystaniu nukleolitycznych sond typu TaqMan do wykrywania markera wirulencji Bacillus anthracis – genu pag oraz specyficznej sekwencji chromosomalnej rpoB. Opracowano również reakcję multiplex Real-time PCR pozwalającą na równoczesną amplifikację i wykrywanie wymienionego genu oraz specyficznej sekwencji chromosomalnej.
Badania przeprowadzono z użyciem jednego szczepu szczepionkowego i czterech szczepów terenowych laseczki wąglika. Przy ocenie swoistości testów wykorzystano izolaty różnych gatunków rodzaju Bacillus oraz szczepy sześciu innych gatunków drobnoustrojów. Do badań użyto zestaw do PCR QuantiTect (Qiagen) oraz startery swoiste dla genu pag kodującego białko PA i startery do amplifikacji fragmentu specyficznego dla sekwencji chromosomalnej.
Reakcja PCR pozwoliła na wykrycie badanych genów na podstawie obserwacji krzywej amplifikacji. Czułość i liniowość reakcji określono korzystając ze współczynnika regresji. Wykazano wysoki współczynnik regresji wynoszący 0,99 dla wszystkich reakcji.
Testy Real-time charakteryzowały się wysoką czułością i specyficznością.
Summary
The aim of the study was to apply the real-time PCR with TaqMan probes for the detection of Bacillus anthracis virulence marker – gene pag and specific chromosomal sequence rpoB. The multiplex Real-Time PCR was also elaborated, which allows simultaneous amplification and detection of this gene and the specific chromosomal sequence.
The research was conducted on one vaccinal and four field strains of Bacillus anthracis. The assessment of the specificity of the tests involved isolates of other species of the genus Bacillus as well as strains of six other species of microorganisms. The studies were conducted with the PCR QuantiTect kit (Qiagen) and primers specific for the gene pag coding PA protein and primers for the amplification of the specific chromosomal sequence.
PCR enabled the detection of genes under examination by the observation of amplification curves. The sensitivity and linearity of the reactions were determined using a regression coefficient. A high regression coefficient of 0.99 was demonstrated for all the reactions.
The Real-time tests were highly sensitive and specific.
Wstęp
Bacillus anthracis jest Gram-dodatnią laseczką wytwarzającą w środowisku zewnętrznym, przy dostępie tlenu, przetrwalniki. Endospory są bardzo oporne na niesprzyjające warunki środowiska i są w stanie przetrwać w glebie nawet kilkadziesiąt lat (1). B. anthracis wywołuje zakaźną chorobę zwaną wąglikiem. Szczególnie wrażliwe na zachorowanie są zwierzęta roślinożerne, rzadziej występuje u wszystkożernych, mięsożernych oraz u ludzi. U człowieka, w zależności od drogi zakażenia wąglik może przebiegać w trzech postaciach: skórnej, związanej z uszkodzeniem i zakażeniem skóry, płucnej w wyniku wdychania przetrwalników wąglika oraz jelitowej wskutek spożywania zakażonej żywności lub wody (2, 3, 4, 5).
Obecnie w Europie notuje się corocznie sporadyczne przypadki wąglika. Jednak za celowością badań nad tym drobnoustrojem przemawia możliwość niekontrolowanego importu surowców i produktów pochodzenia zwierzęcego z terenów, gdzie wąglik występuje nadal enzootycznie, jak na przykład w niektórych krajach Azji, Afryki, Ameryki Północnej, byłego Związku Radzieckiego (Kazachstan, Tadżykistan) (5, 6, 7). Wskazuje na to również wymienianie laseczki wąglika na pierwszym miejscu w wykazie czynników broni biologicznej i coraz bardziej niepokojąco sygnalizowany bioterroryzm. Głośne przypadki wykorzystania laseczek wąglika miały miejsce w 2001 roku w Stanach Zjednoczonych, gdzie bakterie zostały rozesłane w przesyłkach pocztowych adresowanych do ważnych instytucji państwowych (8).
Jedną z metod identyfikacji B. anthracis jest badanie hodowlane. Rutynowa diagnostyka laboratoryjna jest jednak czasochłonna. Opiera się ona na ocenie morfologii kolonii, właściwościach fizjologicznych oraz biochemicznych.
B. anthracis jest blisko spokrewniony z kilkoma gatunkami laseczek występującymi w środowisku, takimi jak B. cereus, B. mycoides i B. thuringiensis (9, 10). Duże podobieństwo genetyczne tych gatunków, może stwarzać problemy przy identyfikacji z użyciem konwencjonalnych metod diagnostycznych (11, 12, 13).
Coraz szersze zastosowanie w rozpoznawaniu laseczek B. anthracis mają metody oparte o amplifikację wybranych fragmentów DNA (14). Dzięki swoistym starterom możliwe jest wykrycie genów B. anthracis zlokalizowanych w DNA plazmidu pXO1 (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21) oraz pXO2 (20, 22, 23). Stwierdzenie u B. anthracis obecności wspomnianych plazmidów świadczy o wirulencji badanego szczepu, co ma wartość diagnostyczną (10, 24, 25).
Stosowane w laboratoriach konwencjonalne testy PCR oraz Real-time PCR stanowią wartościowe narzędzie diagnostyczne (1, 26, 27). Zastosowanie Real-time PCR przynosi rozwiązanie większości problemów istniejących w klasycznej metodzie PCR. Technika ta skraca czas oczekiwania na wynik, zmniejsza ryzyko kontaminacji próbki ze względu na brak obróbki po amplifikacji oraz pozwala na zwiększenie czułości i skuteczności metody (10).
Celem prezentowanych badań było zastosowanie metody Real-time PCR, opartej na wykorzystaniu sond nukleolitycznych TaqMan, do wykrywania genu zlokalizowanego w DNA plazmidu pXO1 (gen pag) oraz specyficznej sekwencji chromosomalnej rpoB szczepów B. anthracis (10, 28). W badaniach wykorzystano również reakcję multiplex Real-time PCR pozwalającą na równoczesną amplifikację i wykrywanie genu pag oraz specyficznej sekwencji chromosomalnej.
Materiał i metody
Szczepy bakteryjne. Badania przeprowadzono przy użyciu szczepionkowego szczepu B. anthracis (BS4). Do oceny swoistości testów wykorzystano cztery szczepy terenowe (B.a.1/47, B.a.3/47, B.a.15/93, B.a.16/96), izolaty innych gatunków rodzaju Bacillus, tj. 2 szczepy B. cereus: B. cereus ATCC 11778, B. cereus 1470 oraz po jednym szczepie B. brevis 1114, B. subtilis ATCC 6633 i B. megaterium 1534. Dodatkowo do doświadczenia włączono szczepy innych gatunków drobnoustrojów: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Listeria monocytogenes ATCC 7644, Pasteurella multocida M1404, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028 i Klebsiella pneumoniae ATCC 13883. Wszystkie szczepy B. anthracis użyte do badań pochodziły z kolekcji drobnoustrojów Zakładu Mikrobiologii PIWet-PIB. Z kolekcji tej otrzymano również szczepy referencyjne innych gatunków bakterii. Natomiast szczep P. multocida M1404 pochodził z National Animal Disease Centre, Ames, Iowa, USA.
Izolacja DNA. Każdy szczep posiewano na 1 ml podłoża TSB (bioMérieux). Posiewy inkubowano 18 godz. w temp. 37°C. Hodowlę bakteryjną wirowano przez 10 min. przy 7500 obr./min. Supernatant usuwano a osad używano do izolacji DNA przy użyciu zestawu Genomic Mini (zestaw do izolacji DNA z bakterii, hodowli komórkowych i tkanek stałych) firmy A&A Biotechnology, Gdynia, Polska. Osad z każdej próbki zawieszano w 100 μl buforu Tris. Próbki poddawano wstępnej inkubacji z dodatkiem 10 μl mutanolizyny (Sigma) – 1 mg/ml przez 10 min. w temp. 37°C. Dalej postępowano wg protokołu podanego przez producenta.
Koncentrację otrzymanego DNA określano spektrofotometrycznie przy użyciu GeneQuant pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare – Amersham Biosciences.
Startery i sondy. W oparciu o dane z piśmiennictwa wybrano sekwencje starterów i sond do amplifikacji (10). Charakterystykę starterów i sond nukleolitycznych TaqMan do reakcji przedstawiono w tabelach 1 i 2. Zostały one zsyntetyzowane w Pracowni Sekwencjonowania DNA IBB PAN.
Tabela 1. Charakterystyka starterów użytych do Real-time PCR.
| Startery | Sekwencja | Wielkość produktu | Koncentracja |
| rpoB gene | rpoB-S | CCACCAACAGTAGAAAATGCC | 175 pz | 0,3 μM |
| rpoB-R | AAATTTCACCAGTTTCTGGATCT |
| pag | PA-S | CGGATCAAGTATATGGGAATATAGCAA | 204 pz | 0,3 μM |
| PA-R | CCGGTTTAGTCGTTTCTAATGGAT |
Tabela 2. Charakterystyka sond nukleolitycznych użytych do Real-time PCR.
| Sondy TaqMan | Sekwencja | Koncentracja |
| rpoB gene | rpoB-TM | 5’-FAM-ACTTGTGTCTCGTTTCTTCGATCCAAAGCG-TAMRA-3’ | 0,4 μM |
| pag | PA-TM | 5’-FAM-CTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAAT-TAMRA-3’ | 0,4 μM |
| PA-BHQ | 5’-HEX-CTCGAACTGGAGTGAAGTGTTACCGCAAAT-BHQ-3’ | 0,4 μM |
Real-time PCR. Reakcję prowadzono w probówkach optycznych MicroAmp Optical Tube zamykanych wieczkami optycznymi Optical Caps (Applied Biosystems). W badaniach wykorzystano zestaw QuantiTect Probe PCR Kit (Qiagen). Zestaw ten stanowi mieszanina polimerazy HotStarTaq, buforu QuantiTect Probe PCR, dNTP, 8 mM MgCl2 oraz barwnika referencyjnego ROX , gotowa do użycia po dwukrotnym rozcieńczeniu w wodzie.
Reakcję Real-time PCR z użyciem primerów rpo-S i rpo-R, w celu wykrycia obecności sekwencji chromosomalnej rpoB, wykonano w 25 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 500 ng DNA, 1,0 μM każdego primera oraz 0,4 μM sondy TaqMan znakowanej barwnikami fluorescencyjnymi FAM (reporter) i TAMRA (akceptor).
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Kohler TM, Dai Z, Kaufman-Yarbray M: Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a trans-acting element activate transcription from one of two promoters. J Bacteriol 1994; 176, 586-595.
2. Dixon TC, Meselson M, Guillemin J, Hanne PC: Antrax. N Engl J Med 1999; 341, 815-826.
3. Franz DR, Jahrling PB, Friedlander AM et al.: Clinical recognition and management of patients exposed to biological warfare agents. JAMA 1997; 278, 399-411.
4. Sohni Y, Kanjilal S, Kapur V: Performance evaluation of fine commercial Real-time PCR reagent systems Rusing TaqMan assays for Bacillus anthracis detection. Clin Biochem 2008; 41, 640-644.
5. Turnbull P: Antrax in Humans and Animals. WHO, Genewa 2008.
6. Charakasskiy BC: A national register of historic and contemporary anthrax foci. J Appl Microbiol 1999; 87, 192-195.
7. Fellows PF: A survey of world vide strains of Bacillus anthracis. Salisbury Med Bulletin, Special Suppl. 1996; 87, 31-33.
8. Zieliński KW, Brocki M, Janiak MK, Wiśniewski A: Patologia wąglika. [W:] Patologia obrażeń i schorzeń wywołanych współczesną bronią w działaniach wojennych i terrorystycznych. Wyd. MON, Warszawa 2010; 353-377.
9. Bode E, Hurtle W, Norwood D: Real-Time PCR assay for a unique chromosomal sequence of Bacillus anthracis. J Clin Microbiol 2004; 42, 5825-5831.
10. Ellerbrok H, Nettermann H, Özel M et al.: Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiol Lett 2002; 214, 51-59.
11. Helgason E, Okstad OA, Caugant DA et al.: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis – one species on the basis of genetic evidence. Appl Environ Microbiol 2000; 66, 2627-2630.
12. Keim P, Klevystka AM, Price LB et al.: Molecular divercity in Bacillus anthracis. J Appl Microbiol 1999; 87, 215-217.
13. Prince LB, Hugh-Jones M, Jackson PJ, Keim P: Genetic diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis. J Bacteriol 1999; 181, 2358-2362.
14. Mullis K, Faloona F, Scharf S et al.: Specific enzymatic amplification and detection of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Biotechnology 1992; 24, 17-27.
15. Adone R, Pasquali P, La Rosa G et al.: Sequence analysis of the genes encoding for the major virulence factors of Bacillus anthracis vaccine strain Carbosap. J Appl Microbiol 2002; 93, 117-121.
16. Bragg TS, Robertson DL: Nucleoide sequence of the lethal factor gene from Bacillus anthracis. Gene 1989; 81, 45-54.
17. Makino S, Cheun HI, Watarai M et al.: Detection of anthrax spores from air by real-time PCR. Let Appl Microbiol 2001; 33, 237-240.
18. Mikesell P, Ivins BE, Ristroph JD, Dreier TM: Evidence for plasmid mediated toxin production in Bacillus anthracis. Infect Immun 1983; 39, 371-376.
19. Okinaka R, Cloud K, Hampton O et al.: Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes. J Bacteriol 1999; 181, 6509-6515.
20. Turnbull PC, Hutson RA, Ward MJ et al.: Bacillus anthracis but not always anthrax. J Appl Bacteriol 1992; 72, 21-28.
21. Welkos SL: Plasmid – associated virulence factors of non-toxigenic (pXO1) Bacillus anthracis. Microb Pathog 1991; 10, 183-198.
22. Makino S, Uchida I, Terakado N et al.: Molecular characterization and protein analysis of the cap region, which is essential for encapsulation in Bacillus anthracis. J Bacteriol 1989; 171, 722-730.
23. Uchida I, Sekizaki T, Hashimoto K, Terakado N: Association of the encapsulation of Bacillus anthracis whit a 60 megadalton plazmid. J Gen Microbiol 1985; 131, 363-367.
24. Kaspar RL, Robertson DL: Purification and physical analysis of Bacillus anthracis plasmids pXO1 and pXO2. Biochem Biophys Res Commun 1987; 149, 362-368.
25. Okinaka R, Cloud K, Hampton O et al.: Sequence assembly and analysis of pXO1 and pXO2. J Appl Microbiol 1999; 87, 261-262.
26. Morrison TB, Weis JJ, Wittwer CT: Quantification of low copy transcripts by continuons SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 1998; 24, 954-962.
27. Stadejek T: Postęp w rozwoju techniki cyklicznej polimeryzacji DNA in vitro – Real-Time PCR. Medycyna Wet 2006; 62, 390-394.
28. Qi Y, Patra G, Liang X et al.: Utlization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis. Appl Environ Microbiol 2001; 67, 3720-3727.
29. Stadejek T, Janicka K, Pejsak Z: Zastosowanie Real-Time PCR do wykrywania zakażeń pestiwirusowych. Medycyna Wet 2006; 62, 165-169.
30. Clementi M.: Quantitative molecular analysis of virus Expression and replication. J Clin Microbiol 2000; 38, 2030-2036.
31. Sohni Y, Kanjilal S, Kapur V: Performance evaluation of fine commercial Real-time PCR reagent systems Rusing TaqMan assays for Bacillus anthracis detection. Clin Biochem 2008; 41,640-644.
32. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM: Real time quantitative PCR. Genome Res 1996; 6, 986-994.
33. Budniak S, Kędrak-Jabłońska A, Reksa M et al.: Zastosowanie metody Real-time PCR opartej na fluorescencji barwnika SYBR Green I do wykrywania genów zlokalizowanych w DNA plazmidów pXO1 i pXO2 oraz specyficznej sekwencji chromosomalnej rpoB szczepów Bacillus antracis. Med Wet 2010; 66, 630-634.
34. Hurtle W, Bode E, Kulesh DA et al.: Detection of the Bacillus anthracis gyrA Gene by Using a Minor Groove Binder Probe. J Clin Microb 2004; 42, 179-185.
35. Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT: Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem 1997; 245, 154-160.
