© Borgis - Postępy Fitoterapii 1/2012, s. 3-10
Kamila Syska1, Anna Kosiorek1, Anna Podsędek2, Marcin Różalski1, *Jacek Golański1
Propozycja procedury oceny przeciwpłytkowych właściwości preparatów polifenolowych pochodzenia roślinnego w badaniach in vitro**
A proposal of the in vitro laboratory procedure for determination antiplatelet properties of polyphenolic extracts of plant origin
1Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Cezary Watała
2Instytut Biochemii Technicznej, Politechnika Łódzka
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. inż. Stanisław Bielecki
Summary
Polyphenolic compounds have pleiotropic effects including the ability to reduce platelet aggregation. However, a commonly approved procedure allowing to detect the antiplatelet properties of these compounds has not been established yet. The aim of our study was to identify the best methods (laboratory procedures) to study the impact of polyphenolic compounds contained in plant extracts on ADP-induced platelet reactivity. The experiment consisted of two steps. At first, from among four plant extracts (Aronox®, Pycnogenol®, grape seeds, raspberry seeds) we chose the extract having the strongest inhibitory effect on platelet aggregation. We decide to use the optical aggregometry as a scrreening method, since it is regarded as the gold standard in studies of platelets’ reactivity. In next step, we selected the most effective method of detecting in vitro antiplatelet properties of polyphenolic extracts. Totally, we compared: light transmission aggregometry (LTA), impedance agreggometry (MEA), platelet adhesion (Impact-R), expression of selected surface membrane platelet receptors (flow cytometry). In the first step of our experiment, the best inhibitor of platelet aggregation was grape seed extract. In the second step, we found that LTA was the best technique since it allowed to detect a significant inhibition of platelets under by grape seed extract (inhibition score 6). Thus, LTA defended its gold standard position. Our results suggested also that impedance aggregometry (inhibition score 4) was also useful in detection of antiplatelet effects of grape seed extract, whereas Impact-R and flow cytometry were not suitable methods in this case (inhibition score 1 and 0, respectively).
Wstęp
Badania epidemiologiczne wskazują, że wysokie spożycie owoców i warzyw jest ważnym czynnikiem redukującym występowanie chorób sercowo-naczyniowych (1). Korzyści, jakie płyną ze spożywania pokarmów pochodzenia roślinnego, mogą wynikać z właściwości przeciwpłytkowych polifenoli (2, 3). Spośród licznych surowców roślinnych hamujących aktywację i reaktywność płytek krwi (4), cztery zostaną bliżej omówione.
Liście i owoce winorośli właściwej (Vitis vinifera L.) są bogatym źródłem związków polifenolowych (5). Opisanie przez Reneuda (6) w 1992 roku zjawiska, znanego jako „paradoks francuski”, zapoczątkowało zainteresowanie polifenolami roślinnymi, jako związkami o właściwościach przeciwpłytkowych. Związki te, zawarte w owocach czerwonych winogron, hamują aktywność płytek krwi (7), między innymi ze względu na to, iż zawarte w nich flawonoidy hamują działanie cyklooksygenazy, redukują produkcję tromboksanu A2 i nadtlenku wodoru w płytkach krwi oraz hamują aktywację fosfolipazy C i kinazy białkowej C (8). Wykazano również, że resweratrol znajdujący się w ekstrakcie z owoców winogron odpowiedzialny jest za zmniejszenie produkcji anionu ponadtlenkowego (O2•) oraz zwiększenie produkcji tlenku azotu (NO•) w płytkach krwi (9). Freedman i wsp. (10) opisują, iż czternastodniowe spożycie soku winogronowego obniża agregację płytek krwi u zdrowych ochotników. Dohadwala i wsp. (8) opisują plejotropowe działanie polifenoli pochodzących z czerwonych winogron.
Bogatym źródłem związków polifenolowych są owoce aronii czarnoowocowej (Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot). Głównymi reprezentantami polifenoli w dojrzałych owocach aronii są: antocyjany (glikozydowe pochodne antocyjanidyny), flawony, flawonole, katechiny (dimery, trimery) oraz kwasy fenolowe (11). Wykazano, że polifenole pochodzące z owoców aronii wykazują właściwości przeciwpłytkowe (3, 12).
Olas i wsp. (3) oraz Ryszawa i wsp. (12) wskazują, że ekstrakt z owoców aronii wykazuje właściwości antyagregacyjne. Opisany jest także efekt oddziaływań pośrednich tego ekstraktu. W badaniach in vitro poprawiał on przeciwpłytkową aktywność śródbłonka naczyniowego (13). Kulling i wsp. (14) opisują wszechstronny korzystny wpływ polifenoli pochodzących z owoców aroni czarnoowocowej na zdrowie człowieka, w tym na układ sercowo-naczyniowy.
Piknogenol (Pycnogenol®) – wyciąg z kory sosny śródziemnomorskiej (Pinus pinaster Sol.), pozyskiwany w południowej części Francji, stanowi bogate źródło flawonoidów (katechiny, epikatechiny, monomerów, dimerów katechin i epikatechin, oligomerów procyjanidyny) oraz kwasów fenolowych (ferulowego, kawowego). Zaobserwowano, że u palaczy tytoniu piknogenol działa antyagregacyjnie oraz obniża stężenie tromboksanu w surowicy (15). Również u osób niepalących preparat ten hamuje agregację i adhezję płytek krwi (16). Farmakologiczne właściwości piknogenolu podsumowuje w swojej publikacji Rohdewald (17).
W przeciwieństwie do wyżej wymienionych, kardioprotekcyjne, w tym przeciwpłytkowe właściwości preparatów pozyskiwanych z różnych części roślin z rodzaju Malina (Rubus L.) nie są dokładnie opisane. Wzmianki na temat polifenolowych ekstraktów uzyskiwanych z owoców malin można znaleźć w pracach opisujących plejotropowe działanie antocyjanin (18). Badania prowadzone przez Torres-Urrutia i wsp. (19) wykazały, że ekstrakt z owoców malin ma właściwości antykoagulacyjne i profibrynolityczne. Brak jest doniesień na temat aktywności biologicznej ekstraktów z pestek malin, stąd włączenie do badań takiego preparatu pozwoli na wstępną ocenę jego właściwości przeciwpłytkowych.
Ze względu na rosnące zainteresowanie preparatami polifenolowymi pochodzenia roślinnego, jako potencjalnym źródłom nowych leków przeciwpłytkowych, niezbędne jest opracowanie procedury, która pozwoliłaby na wykrywanie działania związków przeciwpłytkowych zawartych w ekstraktach roślinnych. Wykorzystywana jest w tym celu gównie metoda badania agregacji płytek krwi metodą optyczną (LTA – light transmission aggregometry) (3, 16, 20-22). Opisana na początku lat 60. (23), mimo wielu mankamentów, w badaniach czynności płytek krwi uznawana jest za „złoty standard”. Coraz częściej do badania wpływu preparatów polifenolowych na funkcje płytek krwi stosowane są metody wykorzystujące krew pełną, w tym metoda agregacji impedancyjnej (24-26) i cytometrii przepływowej (27, 28). W dostępnym piśmiennictwie brak jest danych na temat wykorzystania do tego celu agregometru Multiplate (29) oraz analizatora Impact-R (30).
Z analizy informacji zawartych w publikacjach wynika, że do oceny in vitro czynności płytek krwi najczęściej jest stosowana metoda optyczna (LTA). W niniejszej pracy założono, że dołączenie do LTA jednej z metod badania czynności płytek we krwi pełnej wzbogaci i usprawni metodykę wykrywania przeciwpłytkowych właściwości preparatów polifenolowych pochodzenia roślinnego.
Celem pracy było porównanie trzech metod oceny zależnej od ADP reaktywności płytek krwi we krwi pełnej: agregacji impedancyjnej wykonywanej w analizatorze Multiplate®, (MEA), adhezji/agregacji badanej w analizatorze Impact-R® oraz oceny ekspresji wybranych receptorów płytkowych (cytometria przepływowa). Porównanie to ma na celu wskazanie najbardziej użytecznej metody służącej jako uzupełnienie badań wykonywanych za pomocą metody LTA.
Materiał i metody
Ekstrakty roślinne
W eksperymencie wykorzystano 4 ekstrakty roślinne:
– Pycnogenol® (piknogenol) – nazwa handlowa (Horphag Research) – standaryzowany wyciąg z kory sosny śródziemnomorskiej (Pinus pinaster Sol., subsp Ailton Atlantica des Villar.) uzyskano z Drug Research Institute, Modra, SR (Słowacja),
– Aronox® – ekstrakt z owoców aronii czarnoowocowej – Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot, Agropharm SA (Polska),
– Ekstrakt z pestek winorośli właściwej – Vitis vinifera L. (OMNIVIR R), CE Roeper GmbH (Niemcy),
– Ekstrakt z pestek maliny właściwej – Rubus idaeus L., Instytut Biochemii Technicznej, Politechnika Łódzka (Polska).
Zawartość związków polifenolowych w wymienionych ekstraktach przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1. Zawartość związków polifenolowych (mg/g preparatu) oznaczona metodą spektrofotometryczną.
| Preparat | Polifenole ogółem | Flawanole | Proantocyjanidyny |
Pycnogenol®
Aronox®
Ekstrakt z pestek winogron
Ekstrakt z pestek malin | 596,94 ± 19,47
477,72 ± 11,80
409,97 ± 7,08
263,30 ± 16,27 | 285,29 ± 14,57
93,90 ± 2,21
271,77 ± 30,44
93,57 ± 1,19 | 284,22 ± 6,11
nie oznaczono
68,77 ± 5,29
47,64 ± 1,32 |
| Wyniki prezentowane są jako średnia ± błąd standardowy |
Wszystkie powyższe ekstrakty rozpuszczono w 10% DMSO i stosowano w stężeniach – 7,5 oraz 15 μg/ml. Zastosowane stężenia polifenoli mieściły się w dolnych zakresach stężeń stosowanych w podobnych układach badawczych (12, 31).
Krew
Do eksperymentu pobrano krew od 58 zdrowych dawców (20 mężczyzn i 38 kobiet) w wieku 32 ± 6 lat. Osoby uczestniczące w badaniach nie przyjmowały żadnych leków, a analiza morfologii krwi i podstawowych parametrów biochemicznych mieściły się w granicach normy. Krew pobierana była z zastosowaniem zestawów firmy Sarstedt. Antykoagulant dobierano w zależności od metody analizy funkcji płytek krwi (tab. 2).
Tabela 2. Dobór antykoagulantu w zależności od wybranej metody analizy funkcji płytek krwi.
| Metoda analizy funkcji płytek krwi | Stosowany antykoagulant |
Agregacja optyczna
Cytometria przepływowa (pomiar ekspresji selektyny-P
i aktywnej formy glikoproteiny IIb/IIIa)
Impact-R | 3,2% buforowany cytrynian sodowy
(w stosunku krew:antykoagulant wynoszącym 9:1) |
| Agregacja impedancyjna | hirudyna – Refludan® (25 μg/ml) |
Badanie przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Deklaracji Helsińskiej w oparciu o zgodę Komitetu ds. Etyki Badań Naukowych w eksperymentach na ludziach na Uniwersytecie Medycznym w Łodzi (nr RNN/13/07/KB).
Plan eksperymentu
Eksperyment podzielono na dwie części. Pierwsza miała na celu wybór ekstraktu roślinnego najsilniej hamującego aktywację płytek krwi, zależną od ADP, zaś druga wskazanie najbardziej czułej metody, wykrywającej in vitro przeciwpłytkowe właściwości preparatów polifenolowych (przy zastosowaniu tego samego agonisty). Wszystkie preparaty testowano w dwóch stężeniach – 7,5 oraz 15 μg/ml w przeliczeniu na kwas galusowy. W celu porównania ekstraktów/skuteczności metod przyznawano punkty – 1 punkt, gdy badany preparat powodował istotne statystycznie zahamowanie aktywacji płytek krwi w stężeniu 15 μg/ml oraz 2 punkty, jeżeli preparat działał w stężeniu 7,5 μg/ml w przeliczeniu na kwas galusowy.
W pierwszym etapie do oceny przeciwpłytkowych właściwości preparatów zastosowano metodę uznaną za „złoty standard” w tego typu badaniach, czyli metodę optyczną badania agregacji płytek krwi (LTA). Badano ekstrakty z pestek winogron, malin oraz owoców aronii i piknogenol – ekstrakt z kory sosny śródziemnomorskiej. W drugim etapie zastosowano jeden ekstrakt, który w poprzednim etapie najefektywniej hamował płytki krwi. Stosując skalę punktową porównano trzy metody oceny funkcji płytek wykonywane w krwi pełnej. Dla wszystkich zastosowanych w pracy metod (LTA i oceniane metody) wykonano ranking punktowy.
Badanie agregacji płytek krwi metodą agregacji optycznej
Agregacja optyczna uznawana jest za tak zwany „złoty standard” wśród metod stosowanych do określania reaktywności płytek krwi. Opiera się na monitorowaniu i rejestrowaniu zmian w transmitancji światła padającego na próbkę osocza bogatopłytkowego, które zachodzą w trakcie agregacji płytek krwi w odpowiedzi na agonistę (23).
Osocze bogatopłytkowe otrzymano przez odwirowanie krwi pełnej pobranej do probówki z cytrynianem sodu (250 obr./min, 6 min). Do badań wykorzystano osocze bogatopłytkowe o mianie płytek równym 200 x 109/l.
Czas inkubacji osocza z preparatem polifenolowym wynosił 10 min (w temperaturze 37°C). Jako agonistę zastosowano 10 μmol/l ADP, a pomiary prowadzono w układzie sparowanym. Próbę kontrolną stanowiło osocze bogatopłytkowe z odpowiednią objętością 10% DMSO. Agregację płytek krwi monitorowano przez 10 min, za pomocą optycznego agregometru (Chrono-Log 490-2D, Havertown).
Badanie agregacji płytek krwi z wykorzystaniem aparatu Multiplate
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Retelny VS, Neuendorf A, Roth JL. Nutrition protocols for the prevention of cardiovascular disease. Nutr Clin Pract 2008; 23:468-76. 2. Petrovski G, Gurusamy N, Das DK. Resveratrol in cardiovascular health and disease. Ann N Y Acad Sci 2011; 1215:22-33. 3. Olas B, Wachowicz B, Tomczak A i wsp. Comparative anti-platelet and antioxidant properties of polyphenol-rich extracts from: berries of Aronia melanocarpa, seeds of grape and bark of Yucca schidigera in vitro. Platelets 2008; 19:70-7. 4. Nardini M, Natella F, Scaccini C. Role of dietary polyphenols in platelet aggregation. A review of the supplementation studies. Platelets 2007; 18:224-43. 5. Lutomski J, Mścisz A. Znaczenie prewencyjne związków polifenolowych zawartych w winogronach. Post Fitoter 2003; 1:6-10. 6. Renaud S, de Lorgeril M. Wine, alcohol, platelets, and the French paradox for coronary heart disease. Lancet 1992; 339:1523-6. 7. Keevil JG, Osman HE, Reed JD i wsp. Grape juice, but not orange juice or grapefruit juice, inhibits human platelet aggregation. J Nutr 2000; 130:53-6. 8. Dohadwala MM, Vita JA. Grapes and cardiovascular disease. J Nutr 2009; 139:1788S-93S. 9. Gresele P, Pignatelli P, Guglielmini G i wsp. Resveratrol, at concentrations attainable with moderate wine consumption, stimulates human platelet nitric oxide production. J Nutr 2008; 138:1602-8. 10. Freedman JE, Parker C, Li L i wsp. Select flavonoids and whole juice from purple grapes inhibit platelet function and enhance nitric oxide release. Circulation 2001; 103:2792-8. 11. Wolski T, Kalisz O, Prasał M i wsp. Aronia czarnoowocowa – Aronia melanocarpa (Michx.) Eliot – zasobne źródło antyoksydantów. Post Fitoter 2007; 3:145-54. 12. Ryszawa N, Kawczynska-Drozdz A, Pryjma J i wsp. Effects of novel plant antioxidants on platelet superoxide production and aggregation in atherosclerosis. J Physiol Pharmacol 2006; 57:611-26. 13. Luzak B, Golanski J, Rozalski M i wsp. Extract from Aronia melanocarpa fruits potentiates the inhibition of platelet aggregation in the presence of endothelial cells. Arch Med Sci 2010; 6:141-4. 14. Kulling SE, Rawel HM. Chokeberry (Aronia melanocarpa) – A review on the characteristic components and potential health effects. Planta Med 2008; 74:1625-34. 15. Putter M, Grotemeyer KH, Wurthwein G i wsp. Inhibition of smoking-induced platelet aggregation by aspirin and pycnogenol. Thromb Res 1999; 95:155-61. 16. Golanski J, Muchova J, Golanski R i wsp. Does pycnogenol intensify the efficacy of acetylsalicylic acid in the inhibition of platelet function? In vitro experience. Post Hig Med Dośw 2006; 60:316-21. 17. Rohdewald P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a herbal medication with a diverse clinical pharmacology. Int J Clin Pharmacol Ther 2002; 40:158-68. 18. Saluk-Juszczak J. Anthocyanins as components of functional food for cardiovascular risk prevention. Post Hig Med Dośw 2010; 64:451-8. 19. Torres-Urrutia C, Guzman L, Schmeda-Hirschmann G i wsp. Antiplatelet, anticoagulant, and fibrinolytic activity in vitro of extracts from selected fruits and vegetables. Blood Coagul Fibrinol 2011; 22:197-205. 20. Bucki R, Pastore JJ, Giraud F i wsp. Flavonoid inhibition of platelet procoagulant activity and phosphoinositide synthesis. J Thromb Haemost 2003; 1:1820-8. 21. Hubbard GP, Stevens JM, Cicmil M i wsp. Quercetin inhibits collagen-stimulated platelet activation through inhibition of multiple components of the glycoprotein VI signaling pathway. J Thromb Haemost 2003; 1:1079-88. 22. Koleckar V, Brojerova E, Rehakova Z i wsp. In vitro antiplatelet activity of flavonoids from Leuzea carthamoides. Drug Chem Toxicol 2008; 31:27-35. 23. Born GVR. Aggregation of blood platelets by adenosine and its reversal. Nature 1962; 195:927-35. 24. Singh I, Mok M, Christensen AM i wsp. The effects of polyphenols in Olive leaves on platelet function. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2008; 18:127-32. 25. Jantan I, Raweh SM, Sirat HM i wsp. Inhibitory effect of compounds from Zingiberaceae species on human platelet aggregation. Phytomed 2008; 15:306-9. 26. Shanmuganayagam D, Beahm MR, Osman HE i wsp. Grape seed and grape skin extracts elicit a greater antiplatelet effect when used in combination than when used individually in dogs and humans. J Nutr 2002; 132:3592-8. 27. Heptinstall S, May J, Fox S i wsp. Cocoa flavanols and platelet and leukocyte function: recent in vitro and ex vivo studies in healthy adults. J Cardiovasc Pharmacol 2006; 47 (Suppl 2):S197-S205. 28. Pearson DA, Paglieroni TG, Rein D i wsp. The effects of flavanol-rich cocoa and aspirin on ex vivo platelet function. Thromb Res 2002; 106:191-7. 29. Toth O, Calatzis A, Penz S i wsp. Multiple electrode aggregometry: a new device to measure platelet aggregation in whole blood. Thromb Haemost 2006; 96:781-8. 30. Jilma-Stohlawetz P, Horvath M, Eichelberger B i wsp. Platelet function under high-shear conditions from platelet concentrates. Transfusion 2008; 48:129-35. 31. Olas B, Wachowicz B, Nowak P i wsp. Studies on antioxidant properties of polyphenol-rich extract from berries of Aronia melanocarpa in blood platelets. J Physiol Pharmacol 2008; 59:823-35. 32. Boncler M, Luzak B, Rozalski M i wsp. Acetylsalicylic acid is compounding to antiplatelet effect of C-reactive protein. Thromb Res 2007; 119:209-16.
