© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 7/2012, s. 569-575
*Barbara Piątosa1, Maja Klaudel-Dreszler2
Zastosowanie cytometrii przepływowej w diagnostyce neutropenii
Flow cytometry in diagnostics of neutropenia
1Pracownia Zgodności Tkankowej, Instytut „Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Kierownik Pracowni: dr n. przyr. Barbara Piątosa
2Klinika Immunologii Klinicznej, Instytut „Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka”, Warszawa
Kierownik Kliniki: prof. dr hab. med. Ewa Bernatowska
Streszczenie
Granulocyty wielojądrzaste, neutrofile, stanowią najważniejszy element komórkowy wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Powstają one w szpiku na drodze różnicowania z wielopotencjalnej komórki macierzystej. Kolejne stadia różnicowania różnią się pomiędzy sobą morfologicznie, zdolnością do podziałów, metabolicznie, a także ekspresją antygenów powierzchniowych. Niewystarczająca liczba lub aktywność neutrofili manifestuje się zakażeniami, czasem o dramatycznym przebiegu.
Neutropenia jest heterogenną grupą zaburzeń charakteryzujących się zwiększoną podatnością na zakażenia bakteryjne. Najczęściej jest wtórna do działania leków, czynników środowiskowych lub niektórych patogenów. Może być jednak warunkowana genetycznie i spowodowana zaburzeniami granulopoezy w następstwie zahamowania dojrzewania, wzmożonej apoptozy lub retencji dojrzałych granulocytów w szpiku. Wykorzystując różnice w ekspresji antygenów powierzchniowych cytometria przepływowa pozwala na ocenę poszczególnych stadiów rozwojowych linii mieloidalnej, umożliwiając zarówno badanie defektów rozwojowych, ocenę nadmiernego niszczenia obwodowego komórek linii mieloidalnej, jak i towarzyszących neutropenii zaburzeń w zakresie innych komórek układu odpornościowego. Technika ta pozwala także na badanie sprawności mechanizmów związanych z aktywnością bójczą komórek żernych oraz wykrywanie przeciwciał będących przyczyną neutropenii powstałej w przebiegu procesów immunizacyjnych. Przedstawiono wybrane przykłady wykorzystania cytometrii w diagnostyce neutropenii wrodzonej oraz będącej skutkiem procesów immunizacji.
Złożoność patomechanizmów prowadzących do przewlekłej neutropenii sprawia, że wyniki badań cytometrycznych dostarczają informacji komplementarnych do klasycznych badań morfologicznych. Pozwalają bowiem na zbadanie bardzo dużej liczby komórek, umożliwiają równoczesną ocenę innych niż mieloidalna linii komórkowych oraz aktywności enzymów kluczowych dla prawidłowej funkcji granulocytów. Dzięki temu, w wielu przypadkach, możliwe jest znaczne skrócenie czasu potrzebnego do ustalenia prawidłowego rozpoznania i wdrożenia właściwego postępowania terapeutycznego.
Summary
Polymorphonuclear granulocytes, neutrophils, are the most important cellular components of innate immune response. They are produced in bone marrow during a complex differentiation process from multipotential stem cells. Individual differentiation stages differ in morphology, proliferating ability and metabolic features. Inadequate number or activity of neutrophils is manifested by infections, which may be extremely severe.
Neutropenia composes a heterogeneous group of disorders with increased susceptibility to bacterial infections. Most usually, neutropenia is drug-related or secondary to environmental factors or pathogens. It may be also congenital, associated with defective granulopoiesis due to maturation defects, increased apoptosis or myelokathexis. Differences in expression of surface antigens among individual myeloid maturation stages make flow cytometry a useful tool in evaluation of granulopoiesis and its defects, as well as diagnostics of neutropenia associated with other cellular disorders. The technique allows also evaluation of efficiency of killing mechanisms, as well as detection of anti-granulocyte antibodies causing immune neutropenia. Selected examples of application of flow cytometry in diagnostics of congenital and immune neutropenia have been presented.
Complexity of pathomechanisms leading to chronic neutropenia makes flow cytometry a very useful tool, providing pieces of information complementary to classical morphologic studies. It allows analysis of very large number of myeloid cells, simultaneous examination of other cell lines, as well as evaluation of activity of enzymes, leading to significant reduction of time necessary to obtain correct diagnosis and implementation of adequate therapy.
WSTĘP
Granulocyty wielojądrzaste, neutrofile, stanowią najważniejszy element komórkowy wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Powstają one w szpiku na drodze różnicowania z wielopotencjalnej komórki macierzystej. Kolejne stadia różnicowania, od najmłodszego mieloblasta poprzez promielocyt, mielocyt, metamielocyt, granulocyt z jądrem pałeczkowatym po neutrofil z jądrem segmentowanym, różnią się pomiędzy sobą morfologicznie, zdolnością do podziałów, metabolicznie, a także ekspresją antygenów powierzchniowych (1). Dojrzewanie od etapu mieloblasta do dojrzałego neutrofila z jądrem podzielonym trwa około 10-12 dni. Neutrofile są komórkami krótkożyjącymi (12-72 godzin), lecz dzięki ekspresji swoistych receptorów ułatwiających toczenie, wiązanie i przyleganie do śródbłonka naczyniowego i produkcji licznych cytokin i chemokin mogą działać w pierwszej linii obrony (2, 3). Granulocyty wielojądrzaste odgrywają zasadniczą rolę w odpowiedzi zapalnej na zakażenia bakteryjne i grzybicze (4, 5), gojeniu ran i sterowaniu odpowiedzią immunologiczną (6). Niewystarczająca liczba lub aktywność neutrofili manifestuje się zakażeniami, czasem o dramatycznym przebiegu.
Neutropenia jest to obniżenie całkowitej liczby neutrofilów we krwi obwodowej poniżej 1500 komórek/mm3, najczęściej wtórnie do działania czynników środowiskowych, niektórych patogenów lub leków. Może być jednak spowodowana obecnością auto- lub alloprzeciwciał, względnie powstawać w wyniku defektów genetycznych (4). Zmniejszenie całkowitej liczby neutrofili poniżej 1000 komórek/mm3 wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zakażeń, natomiast ciężkich infekcji – po zmniejszeniu liczby neutrofili poniżej 500 komórek/mm3 (7). Ze względu na fizjologiczne zmiany liczby neutrofili w różnych grupach wiekowych definicja neutropenii zmieniona została dla dzieci pomiędzy 2. a 24. miesiącem życia, dla których za neutropenię uważa się spadek liczby neutrofili poniżej 1000 komórek/mm3 (8, 9).
Za neutropenię wrodzoną uważa się wszystkie uwarunkowane genetycznie defekty związane ze zmniejszeniem liczby neutrofili (10). Jest to heterogenna grupa zaburzeń charakteryzujących się zwiększoną podatnością na zakażenia bakteryjne, spowodowaną zaburzeniami granulopoezy w następstwie zahamowania dojrzewania, wzmożonej apoptozy lub retencji dojrzałych granulocytów w szpiku. Nieprawidłowym wynikom badania morfologicznego krwi obwodowej i szpiku towarzyszą charakterystyczne objawy kliniczne.
Cytometria przepływowa jest techniką analityczną pozwalającą na szybki pomiar rozproszonego światła lub sygnałów fluorescencji emitowanych przez odpowiednio naświetlone komórki. Umożliwia zarówno jakościową, jak i ilościową ocenę właściwości fizycznych i biologicznych komórek oraz niektórych ich składowych. Metoda ta została odkryta jako ulepszenie mikroskopu fluorescencyjnego i cechuje się wysoką wydajnością, która pozwala na analizowanie różnych parametrów w dużej liczbie komórek, w stosunkowo krótkim czasie. W ostatnich latach cytometria przepływowa stała się ważną techniką stosowaną w diagnostyce i monitorowaniu różnych zaburzeń komórkowych, nie tylko pierwotnych niedoborów odporności związanych z defektami limfocytów, ale także w ocenie zaburzeń różnicowania i dojrzewania pozostałych linii hematopoetycznych (11), umożliwiając zarówno badanie defektów rozwojowych linii mieloidalnej, jak i ocenę nadmiernego niszczenia obwodowego, sprawności mechanizmów związanych z aktywnością bójczą komórek żernych oraz towarzyszących neutropenii zaburzeń w zakresie innych komórek układu odpornościowego. Uzyskane informacje pomagają w ocenie patomechanizmu choroby, mogą również wskazać ewentualne drogi w postępowaniu terapeutycznym, szczególnie w przypadkach o niejednoznacznym obrazie klinicznym. Poniżej zostaną przedstawione wybrane przykłady wykorzystania cytometrii w diagnostyce neutropenii.
Ocena granulopoezy szpikowej
Szpik stanowi złożoną tkankę, zawierającą komórki należące do wielu linii, znajdujące się na różnych etapach rozwoju. Dojrzewaniu granulocytów, podobnie jak innych komórek hematopoezy szpikowej towarzyszy zmiana ekspresji antygenów powierzchniowych, odzwierciedlająca poszczególne etapy dojrzewania. Odpowiednie kompozycje przeciwciał monoklonalnych umożliwiają skuteczną ocenę granulopoezy szpikowej, z wykorzystaniem np. przeciwciał skierowanych przeciwko molekułom powierzchniowym CD10, CD11b, CD13, CD16, CD24, CD33, CD34, CD35, CD45, CD49d, CD64, CD87, CD117 (tab. 1) (1, 11, 12).
Tabela 1. Ekspresja powierzchniowa markerów charakterystycznych dla poszczególnych stadiów rozwojowych linii granulocytarnej obecnych w szpiku. Znaczenie symboli i skrótów: – brak ekspresji, + słaba ekspresja, ++ umiarkowana ekspresja, +++ silna ekspresja; blast – mieloblast, promielo – promielocyt, mielo – mielocyt, metamielo – metamielocyt, pałka – neutrofil z jądrem pałeczkowatym, segment – neutrofil z jądrem segmentowanym.
| Marker powierzchniowy | Blast | Promielo | Mielo | Metamielo | Pałka | Segment |
| CD10 | – | – | – | – | – | ++ |
| CD11b | – | – | +/++ | ++ | ++ | ++ |
| CD13 | ++ | ++ | + | + | + | ++ |
| CD16 | – | – | – | + | ++ | +++ |
| CD24 | | – | ++ | ++ | ++ | ++ |
| CD33 | +++ | +++ | ++ | + | + | + |
| CD34 | + | – | – | – | – | – |
| CD35 | – | – | – | – | ++ | ++ |
| CD49d | ++ | ++ | ++ | + | – | – |
| CD64 | | + | ++ | ++ | – | – |
| CD87 | | | | | ++ | ++ |
| CD117 | + | – | – | – | – | – |
| HLA-DR | + | – | – | – | – | – |
Cytometria w diagnostyce neutropenii, w których głównym zaburzeniem jest defekt dojrzewania linii mieloidalnej
Ocena granulopoezy szpikowej przydatna jest w neutropeniach spowodowanych zahamowaniem dojrzewania linii mieloidalnej w szpiku. W niektórych przypadkach zaburzeniom granulopoezy towarzyszą także zaburzenia ilościowe lub jakościowe dotyczące innych linii komórkowych.
Ciężka wrodzona neutropenia (severe congenital neutropenia – SCN) stanowi heterogenną grupę niedoborów charakteryzujących się istotnym zmniejszeniem liczby neutrofili w szpiku oraz krwi obwodowej, będąc przyczyną nawracających ciężkich zakażeń bakteryjnych, rzadziej grzybiczych (13). Mutacje w genie ELANE (dawniej ELA2), kodującym elastazę neutrofili, odpowiadają za około 50% ciężkiej wrodzonej neutropenii, dziedziczonej w sposób autosomalny dominujący, przejawiającej się w postaci przewlekłej lub cyklicznej (14). Neutropenia spowodowana jest nasileniem apoptozy komórek progenitorowych linii granulocytarnej, co daje obraz pozornego „bloku dojrzewania” na etapie promielocyta lub mielocyta (14, 15). Opisano przeszło 50 różnych mutacji, jednakże nie znaleziono związku pomiędzy poszczególnymi mutacjami a obrazem klinicznym, z wyjątkiem mutacji G185R, w wyniku której obserwuje się agranulocytozę, oporność na leczenie G-CSF oraz zwiększoną podatność na rozwinięcie białaczki (16).
W badaniu cytometrycznym szpiku można wykazać „zahamowanie” dojrzewania linii mieloidalnej. We krwi obwodowej zaobserwowano ponadto o połowę niższą ekspresję wewnątrzkomórkową katelicydyny (CAMP) i lipokaliny (NGAL) w ziarnistościach wtórnych neutrofili (17).
Głęboki niedobór dojrzałych postaci komórek linii mieloidalnej, podobny jak w mutacjach ELANE, możliwy do wykrycia za pomocą cytometrii przepływowej obserwuje się również w zespole Kostmanna warunkowanym mutacją w genie HAX1 (18). Mutacje w HAX1 są także przyczyną zaburzeń w obwodowym dojrzewaniu limfocytów B (19).
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Elghetany MT: Surface antigen changes during normal neutrophilic development: A critical review. Blood Cells, Molecules and Diseases 2002; 28: 260-274.
2. Dinauer MC, Lekstrom-Himes JA, Dale DC: Inherited Neutrophil Disorders: Molecular Basis and New Therapies. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2000; 303-318.
3. Nathan C: Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol 2006; 6: 173-182.
4. van den Berg JM, Kuijpers TW: Defects in number and function of neutrophilic granulocytes causing primary immunodeficiency. Eur J Pediatr 2011; 170: 1369-76.
5. Segal AW: How neutrophils kill microbes. Annu Rev Immun 2005; 23: 197-223.
6. Cowburn AS, Condiliffe AM, Farahi N et al.: Advances in neutrophil biology: clinical complications. Chest 2008; 134: 606-612.
7. Schwartzberg LS: Neutropenia: Etiology and pathogenesis. Clinical Cornerstone 2006; 8 (suppl 5): S5-11.
8. Piątosa B, Wolska-Kuśnierz B, Siewiera K et al.: Distribution of leukocyte and lymphocyte subsets in peripheral blood. Age related normal values for preliminary evaluation of the immune status in Polish children. Centr Eur J Immunol 2010; 30: 168-175.
9. Klaudel-Dreszler M: Przewlekła neutropenia u dzieci – obraz kliniczny, diagnostyka, czynniki prognostyczne oraz leczenie. (Praca doktorska). Instytut Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka. Warszawa 2010.
10. Donadieu J, Fenneteau O, Baupain B et al.: Congenital neutropenia: diagnosis, molecular bases and patient management. Orphanet J Rare Dis 2012; 6: 26.
11. van Lochem EG, van der Velden VHJ, Wind HK et al.: Immunophenotypic differentiation patterns of normal hematopoiesis in human bone marrow: Reference patterns for age-related changes and disease-induced shifts. Cytometry 2004; 60B: 1-13.
12. Elghetany MT, Ge Y, Patel J et al.: Flow cytometric study of neutrophilic granulopoiesis in normal bone marrow using morphologic assessments. J Clin Lab Anal 2004; 18: 36-41.
13. Skokowa J, Germeshausen M, Zeidler C et al.: Severe congenital neutropenia: inheritance and pathophysiology. Curr Opin Hematol 2007; 14: 22-28.
14. Horwitz M, Benson KF, Pearson RE et al.: Mutations in ELA2, encoding neutrophil elastase, define a 21-day biological clock in cyclic haematopoiesis. Nat Genet 1999; 23: 433-436.
15. Dale DC, Person RE, Bolyard AA et al.: Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia. Blood 2000; 96: 2317-2322.
16. Bouma G, Ancliff PJ, Thrasher AJ et al.: Recent advances in the understanding of genetic defects of neutrophil number and function. Br J Haematol 2010; 151: 312-326.
17. Shiohara M, Shigemura T, Saito S et al.: Ela2 mutations and clinical manifestations in familial congenital neutropenia. J Pediatr Hematol Oncol 2009; 31: 319-324.
18. Klein C, Grudzien M, Appaswamy G et al.: Deficiency of HAX1 causes autosomal recessive severe congenital neutropenia (Kostmann disease). Nat Genet 2007; 39: 86-92.
19. Peckl-Schmid D, Wolkerstorfer S, Königsberger S et al.: HAX1 deficiency: impact on lymphopoiesis and B-cell development. Eur J Immunol 2010; 40: 3161-3172.
20. Boztug K, Appaswamy G, Ashikov A et al.: A novel syndrome with severe congenital neutropenia is caused by mutations in G6PC3. N Eng J Med 2009; 360: 32-43.
21. McDermott DH, De Ravin SS, Jun HS et al.: Severe congenital neutropenia resulting from G6PC3 with increased neutrophil CXCR4 expression and myelokathexis. Blood 2010; 116: 2793-2802.
22. Kawai T, Malech HL: WHIM syndrome: congenital immune deficiency disease. Curr Opin Hematol 2009; 16: 20-26.
23. Devriendt K, Kim AS, Mathijs G et al.: Constitutively activating mutation in WASP causes X-linked severe congenital neutropenia. Nat Gen 2001; 27: 313-317.
24. Beel K, Cotter MM, Blatny J et al.: A large kindred with X-linked neutropenia with I274T mutation of the Wiskott-Aldrich syndrome gene. Br J Haematol 2008; 144: 120-126.
25. Parolini O, Berardelli S, Riedl E et al.: Expression of Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) gene during hematopoietic differentiation. Blood 1997; 90: 70-75.
26. Moulding DA, Blundell MP, Spiller DG et al.: Unregulated actin polymerization by WASp causes defects in mitosis and cytokinesis in X-linked neutropenia. J Exp Med 2007; 204: 2213-2224.
27. Nakajima M, Yamada M, Yamaguchi K et al.: Possible application of flow cytometry for evaluation of the structure and functional status of WASP in peripheral blood mononuclear cells. Eur J Haematol 2009; 82: 223-230.
28. Person RE, Li F-Q, Duan Z et al.: Mutations in proto-oncogene GFI1 cause human neutropenia and target ELA2. Nat Genet 2003; 34: 308-312.
29. Notarangelo LD: Primary immunodeficiencies. J Allergy Clin Immunol 2010; 125: S182-194.
30. Legresle-Peyrou C, Six E, Picard C et al.: Human adenylate kinase 2 deficiency causes a profound haematopoietic defect associated with sensoryneural daefness. Nat Gen 2009; 41: 106-111.
31. Pannicke U, Hönig M, Hess I et al.: Reticular dysgenesis (aleukocytosis) is caused by mutations in the gene encoding mitochondrial adenylate kinase 2. Nat Gen 2009; 41: 101-105.
32. Noordzij JG, De Bruin-Versteeg S, Comans-Bitter WM et al.: Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatr Res 2002; 51: 159-168.
33. Kanegane H, Taneichi H, Nomura K et al.: Severe neutropenia in Japanese patients with x-linked agammaglobulinemia. J Clin Immunol. 2005; 25: 491-495.
34. Jacobs ZD, Guajardo JR, Anderson KM: XLA-associated neutropenia treatment: a case report and review of the literature. J Pediatr Hematol Oncol 2008; 30: 631-634.
35. Aghamohammadi A, Cheraghi T, Rezaei N et al.: Neutropenia associated with X-linked Agammaglobulinemia in an Iranian referral center. Iran, J Allergy Asthma Immunol 2009; 8: 43-47.
36. Fututani T, Miyawaki T, Tsukada S et al.: Deficient expression of Bruton’s tyrosine kinase in monocytes from X-linked agammaglobulinemia as evaluated by a flow cytometric analysis and its clinical application to carrier detection. Blood 1998; 91: 595-602.
37. Mc Guire PJ, Cunningham-Rundles C, Ochs H et al.: Oligoclonality, impaired class switch and B-cell memory responses in WHIM syndrome. Clin Immunol 2010; 135: 412-421.
38. Ochtrop ML, Goldacker S, May AM et al.: T and B lymphocyte abnormalities in bone marrow biopsies of common variable immunodeficiency. Blood 2011; 118: 309-318.
39. Levy J, Espanol-Boren T, Thomas C et al.: Clinical spectrum of X-linked hyper-IgM syndrome. J Pediatr 1997; 131: 47-54.
40. Agematsu K, Nagumo H, Shinozaki K et al.: Absence of IgD-CD27+ memory B cell population in X-linked hyper-IgM syndrome. J Clin Invest 1998; 102: 853-860.
41. Mavroudi I, Papadakai V, Pyrovolaki K et al.: The CD40/CD40 ligand interactions exert pleiotropic effects on bone marrow granulopoiesis. J Leukoc Biol 2011; 89: 771-783.
42. Freyer DR, Gowans LK, Warzynski M et al.: Flow cytometric diagnosis of X-linked hyper-IgM syndrome: application of an accurate and convenient procedure. J Pediatr Hematol Oncol 2004; 26: 363-370.
43. Abdollahpour H, Appaswamy G, Kotlarz D et al.: The phenotype of human STK4 deficiency. Blood 2012; doi:10.1182/blood-2011-09-378158.
44. Cross AR, Segal AW: The NADPH oxidase of professional phagocytes-prototype of the NOX electron transport chain systems. Biochim Biophys Acta 2004; 1657: 1-22.
45. Segal AW: The NADPH oxidase and chronic granulomatous disease. Mol Med Today 1996; 2: 129-135.
46. Beaudet AL, Anderson DC, Michels VV et al.: Neutropenia and impaired neutrophil migration in type IB glycogen storage disease. J Pediatr 1980; 97: 906-910.
47. Chou JY, Jun HS, Mansfield BC: Neutropenia in type Ib glycogen storage disease. Curr Opin Hematol 2010; 17: 36-42.
48. Henderson LM, Chappell JB: Dihydrorhodamine 123: a fluorescent probe for superoxide generation? Eur J Biochem 1993; 217: 973-980.
49. O’Gorman MRG, Corrochano V: Rapid whole-blood flow cytometry assay for diagnosis of chronic granulomatous disease. Clin Diagn Lab Immunol 1995; 2: 227-232.
50. Mauch L, Lun A, O’Gorman MRG et al.: Chronic granulomatous disease (CGD) and complete myeloperoxidase deficiency both yield strongly reduced dihydrorhodamine 123 test signals but can be easily discerned in routine testing for CGD. Clin Chem 2007; 54: 890-896.
51. Radhika V, Onesime D, Ha JH et al.: Gα1 3 stimulates cell migration through cortactin-interacting protein Hax-1. J Biol Chem 2004; 279: 49406-49413.
52. Sella R, Flomenblit L, Goldstein I et al.: Detection of anti-neutrophil antibodies in autoimmune neutropenia of infancy: A multicenter study. IMAJ 2010; 12: 91-96.
53. Hwang K, Park C-J, Huh HJ et al.: Flow cytometric detection of neutrophil-associated immunoglobulin in patients with or without neutropenia and establishment of reference intervals. Ann Clin Lab Sci 2011; 41: 144-149.
