Technikę cytometrii przepływowej (flow cytometry – FC) w badaniach krwinek czerwonych zastosowano po raz pierwszy w 1980 roku (1). Oceniano liczbę cząsteczek IgG autoprzeciwciał na krwinkach osób chorych na niedokrwistość autoimmunohemolityczną. Cztery lata później za pomocą FC wykrywano krwinki płodu w krążeniu matki, a w kolejnym roku technikę tę wykorzystano w badaniach antygenów grup krwi, w tym ekspresji antygenów układu Rh w zależności od ich homo- lub heterozygotyczności (2-4).

Metoda cytometryczna pozwala na badania fenotypowe, czyli wykrywanie i identyfikację antygenów krwinek czerwonych za pomocą skierowanych do nich swoistych przeciwciał oraz ocenę mieszanych populacji erytrocytów (5-7). Jest dynamicznie rozwijającą się techniką diagnostyczną, umożliwiającą precyzyjną ocenę pojedynczych komórek przy jednoczesnej analizie dużej ich liczby. W cytometrze krwinki płyną jedna za drugą, a na każdą z nich pada wiązka światła laserowego umożliwiając zróżnicowanie poszczególnych frakcji za pomocą parametrów morfologicznych: wielkości FSC (Forward Scatter Channel) i ziarnistości SSC (Side Scatter Channel) (ryc. 1).

Erytrocyty tworzą dobrze wyodrębnioną, oddzielną populację krwinek, gdy przedstawia się je na wykresie kropkowym tzw. „dot-plot” używając skali logarytmicznej (8), co potwierdzają nasze doświadczenia (ryc. 2).

W celu wykrycia poszukiwanego antygenu znakuje się erytrocyty specyficznymi przeciwciałami, sprzężonymi z odpowiednimi fluorochromami. Zazwyczaj są nimi fikoerytryna (PE) oraz izotiocyjanian fluoresceiny (FITC). Barwniki te wzbudzane przez laser argonowy emitują odpowiednio światło pomarańczowe oraz zielone, przy czym fluorescencja PE daje silniejszy sygnał niż FITC. Do oznaczania frakcji retikulocytów stosuje się barwnik, który wykrywa fragmenty kwasów nukleinowych, pozostających w tych komórkach np. oranż tiazolu (9, 10). Fluorochromy ulegają wzbudzeniu, a intensywność fluorescencji odpowiada ekspresji antygenu. Zależy ona jednak nie tylko od liczby miejsc antygenowych na komórce, ale także od stopnia powinowactwa użytego przeciwciała, czyli siły jego wiązania z determinantami antygenowymi, metody znakowania komórek (bezpośrednia ze znakowanymi swoistymi przeciwciałami lub pośrednia ze znakowanymi przeciwciałami anty-IgG skierowanymi do swoistych nie znakowanych przeciwciał) oraz zastosowania odpowiednich fluorochromów. Różnorodność barwników umożliwia dobór odpowiedniej siły świecenia w zależności od gęstości badanego antygenu i zgodnie z zasadą, że do wyznakowania niezbyt licznych struktur o małej gęstości determinant antygenowych, stosuje się silne fluorochromy i odwrotnie dla dużej ich liczby stosuje się fluorochromy słabe.

Wykorzystując cytometrię do badań antygenów grup krwi, uzyskano wyniki średniej liczby antygenów oraz stopień zróżnicowania ich gęstości na erytrocytach. Stwierdzono, że antygeny o strukturze węglowodanowej (A, B, H, I, i, P) są bardziej zróżnicowane pod względem gęstości (od kilkudziesięciu determinant do setek tysięcy) niż np.: antygeny układów Rh, Kell, Duffy, Kidd (kilkanaście, rzadko kilkadziesiąt tysięcy) (8, 11). Prowadzono też badania dotyczące zmian liczby antygenów A i B z układu ABO oraz związanego z nimi antygenu H z układu H podczas starzenia się erytrocytów, u noworodków oraz u chorych na białaczki mieloblastyczne. We wszystkich wymienionych przypadkach stwierdzono osłabioną ekspresję tych antygenów (12-16).

Nieliczne publikacje donoszą o użyciu cytometrii przepływowej do oceny liczby i rozkładu miejsc antygenu RhD (16, 17). Badano także antygeny Fy^a i Fy^b z układu Duffy, w związku z ich funkcją receptorową dla pierwotniaka malarii Plasmodium vivax. Stwierdzono wyższą ekspresję tych antygenów na retikulocytach niż na krwinkach dojrzałych (19).

Metoda cytometryczna, jako bardzo czuła, jest stosowana do poszukiwań lub potwierdzania obecności nowych antygenów i układów grupowych. Donoszą o tym między innymi publikacje z 2012 roku dotyczące wykrycia układów Langeries i Junior, omówione w pracy przeglądowej w obecnym numerze „Postępów nauk medycznych”. Ze względu na konieczność przeprowadzenia badań populacyjnych antygenów powszechnych Lan i Jr^a, poszukiwania Jr^a u innych ssaków oraz badań ekspresji antygenów na liniach komórkowych transfekowanych odpowiednimi genami i na ludzkich komórkach nowotworowych, metoda cytometryczna była jedyną metodą immunohematologiczną umożliwiającą przeprowadzenie kompletu badań fenotypowych identyfikujących nowe układy grupowe, które następnie potwierdzono badaniami na poziomie DNA (20, 21).

Do wykrywania przeciwciał związanych z krwinkami czerwonymi stosuje się aglutynacyjne testy antyglobulinowe: bezpośredni test antyglobulinowy (BTA) do wykrywania przeciwciał związanych z erytrocytami in vivo oraz pośredni test antyglobulinowy (PTA) do wykrywania wolnych przeciwciał w surowicy po związaniu ich in vitro z krwinkami czerwonymi. Technikę cytometryczną stosowano w badaniu erytrocytów chorych na niedokrwistość autoimmunohemolityczną w następujących celach: do ilościowej oceny cząsteczek IgG przypadających na jedną krwinkę, do wykrywania autoprzeciwciał, gdy wynik BTA był słaby lub ujemny oraz do oznaczania podklas IgG. Technikę tę używano obok techniki aglutynacyjnej, immunoenzymatycznej, radioizotopowej, ponieważ żadna z nich nie została uznana za referencyjną (5, 22, 23).