Przewlekła białaczka limfocytowa (PBL) jest chorobą układu chłonnego, charakteryzującą się akumulacją dojrzałych, aczkolwiek niekompetentnych limfocytów o immunofenotypie CD5+/CD19+/CD23+ z wyraźnie niskim potencjałem apoptotycznym (1, 2). Nowotwór ten występuje głównie u ludzi dorosłych, z częstością zachorowań wzrastającą wraz z wiekiem (3). Etiologia choroby nie została dotąd w pełni wyjaśniona, mimo wielu badań prowadzonych w tym kierunku (4). Przyczyn oporności na obumieranie doszukuje się m.in. w zaburzeniach ekspresji białek rodziny BCL-2. Uwagę zwraca również fakt, że nowotworowe limfocyty w środowisku in vitro, odmiennie niż in vivo, wykazują charakterystyczną zdolność spontanicznej apoptozy (5).

Celem pracy jest ocena spontanicznej apoptozy nowotworowych limfocytów u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową oraz analiza zależności uzyskanych wyników do czynników prognostycznych o uznanym znaczeniu klinicznym w tej chorobie.

Badania przeprowadzono w grupie 22 pacjentów z nowo zdiagnozowaną PBL. Wyizolowane z próbek krwi obwodowej w gradiencie stężeń komórki jednojądrzaste poddano 24-godzinnej hodowli w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO₂. Zarówno komórki świeżo wyizolowane z krwi (0 h), jak i po hodowli (24 h) inkubowano według protokołu producenta z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanym przeciwko badanym strukturom (CD19, CD5, CD23, CD38, ZAP-70, BAX, BCL-2 i kaspaza-3). Analizę i akwizycję danych przeprowadzono z użyciem czterokolorowego cytometru przepływowego FACSCalibur, zliczając 10 tysięcy komórek w każdej próbce. Ustalano bramkę limfocytarną i dalsze badania prowadzono w populacji komórek o immunofenotypie CD19+/CD5+/CD23+. Oceny spontanicznej apoptozy dokonano na podstawie wartości odsetka limfocytów PBL wykazujących ekspresję aktywnej kaspazy-3 po hodowli (w 24 h) oraz stosunku wartości ekspresji białek BCL-2 i BAX (wyrażonych jako MFI – średnia wartość fluorescencji) zaraz po pobraniu materiału (0 h), jak również po dobowej inkubacji komórek (24 h).

W celu określenia nieprawidłowości cytogenetycznych komórek PBL zastosowano technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Wykorzystane zostały sondy wyznaczające regiony zmian cytogenetycznych charakterystyczne dla PBL, tj.: 17p13.1, 11q22.3, 13q13.3+13q34 oraz 12p11.1-q11.1. W wykonanych preparatach, przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, ocenie podlegało 200 jąder komórkowych.

Następnie z wykorzystaniem metod statystycznych i programu Statistica 7.0 poszukiwano współzależności pomiędzy wartościami oznaczonych białek czy ich stosunków a niektórymi czynnikami o uznanym znaczeniu rokowniczym w PBL, tj. stadium zaawansowania klinicznego według Raia, stężeniem dehydrogenazy mleczanowej i β₂-mikroglobuliny, limfocytozą, ekspresją CD38 i ZAP-70 oraz charakterystycznymi zmianami cytogenetycznymi. Do określenia siły korelacji wykorzystano współczynnik rang Spearmana. Analizę porównawczą dwóch prób zmiennych niezależnych wykonano przy pomocy testu U Manna-Whitneya.

W przypadku odsetka komórek z ekspresją aktywnej kaspazy-3, który w komórkach wyizolowanych ze świeżo uzyskanego materiału jest bliski zeru, po 24-godzinnej inkubacji dowiedziono wyraźnie istotny wzrost odsetka limfocytów CD19+/CD5+/CD23+ wykazujących aktywność tego enzymu, determinującego nieodwracalnie wprowadzenie komórki na szlak śmierci zaprogramowanej. Badania wykazały istotne statystycznie obniżenie w populacji białaczkowych limfocytów wartości stosunku białek BCL-2/BAX (MFI) po dobowej hodowli, w porównaniu z wartością ww. stosunku oznaczonego w świeżych próbkach krwi obwodowej pacjentów. Mediana tego stosunku obniżyła się po 24-godzinnej hodowli ponad dwukrotnie, co jest prawdopodobnie efektem w szczególności obniżenia ekspresji białka o działaniu antyapoptotycznym BCL-2.

W celu określenia wzajemnych zależności pomiędzy poszczególnymi zmiennymi przeprowadzono analizę korelacji wymierników apoptozy białaczkowych limfocytów CD19+/CD5+ z czynnikami rokowniczymi w PBL:

– stadium według Rai,

– stężeniem B₂-mikroglobuliny,

– stężeniem dehydrogenazy mleczanowej,

– wartością limfocytozy.

Do opisu siły korelacji dwóch cech wykorzystano współczynnik korelacji rang Spearmana. Za istotne statystycznie przyjmowano wyniki, w przypadku których prawdopodobieństwo popełnienia błędu wynosi mniej niż 5%, a więc wtedy, gdy istotność wynosi p < 0,05.