© Borgis - Postępy Fitoterapii 1/2014, s. 23-27
Janina Drozd, *Elżbieta L. Anuszewska
Działanie immunostymulujące wodnego wyciągu z liści aloesu drzewiastego (Aloe arborescens Mill.)
Immunostimulatory activity of water extract from leaves of Aloe arborescens Mill.
Zakład Biochemii i Biofarmaceutyków, Narodowy Instytut Leków w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. farm. Elżbieta L. Anuszewska
Summary
Genus Aloe was traditionally applied for the medicinal practice over thousands of years and used for treatment of wide range of medical indication from stomach disorders to cancer. Fresh leaves of Aloe arborescens contain various groups of chemical compounds such as: glycoproteins, polysaccharides, hydroxyanthraquinone derivatives, vitamins, minerals, aminoacids and many others, which show multidirectional therapeutic action. These active components are responsible for immunomodulatory, antiinflammatory and antimicrobial effects of Aloe arborescens.
Therefore the aim of our study was to demonstrate that water Aloe arborescens extract positively affects the survival of mouse thymocytes in cultures with hydrocortisone (cytotoxicity test) and increases the count of splenocytes forming spontaneous rosettes with sheep red blood cells (E-rosette test ).The immature thymocytes have steroid receptors on their surface, therefore being sensitive to the lytic action of hydrocortisone, which induces an active process of autodestruction leading to apoptosis. During maturation and obtainment of immunological power the cells lose these receptors and become resistant to steroids. The ability of splenocytes to bind sheep erythrocytes to form spontaneous resettes depends on the binding of glycoprotein structures present on the surface with lipids present on the surface of sheep red blood cells.
The obtained results show that water Aloe arborescens extract increases survival rate of Balb-c mouse thymocytes in cultures with hydrocortisone and increases the ability of splenocytes to attach to sheep erythrocytes in E-rosette test. Comparison of the results for water extract from the Aloe arborescens leaves with those obtained for synthetic immunostimulators: levamisol and isoprinosine, shows no differences between the immunostimulatory activity of both.
Wstęp
Aloes drzewiasty (Aloe arborescens Mill.) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych gatunków z rodzaju Aloe L. Z uwagi na szerokie zastosowanie w przemyśle żywnościowym, kosmetycznym i farmaceutycznym, poza stanowiskami naturalnymi, uprawiany jest na plantacjach, głównie w Japonii, Chinach, obu Amerykach, a także w Polsce. Liście aloesu zawierają do 98% wody; w pozostałych kilku procentach zawartości znajduje się duża liczba biologicznie aktywnych składników (1, 2). Od dziesiątków lat preparaty aloesowe stosowane są w profilaktyce i terapii ludzi i zwierząt, w szeregu takich chorób, jak zakażenia bakteryjne i wirusowe, rany i owrzodzenia oraz choroby układu pokarmowego (3-8). Właściwości przeciwutleniające i stymulujące układ odpornościowy aloesu drzewiastego wykorzystywane są także w profilaktyce i leczeniu wspomagającym chorób cywilizacyjnych; cukrzycy i nowotworów (9, 10).
Od lat pięćdziesiątych na terenie Polski dopuszczony do obrotu jest produkt leczniczy o nazwie Biostymina; płyn doustny, będący wodnym wyciągiem z liści aloesu drzewiastego, pochodzącego z hodowli własnej Zakładów Zielarskich Phytopharm Klęka S.A. Liście roślin trzyletnich po procedurze mycia poddaje się bioaktywacji zgodnie z teorią Fiłatowa. Zakłada ona, że przechowywanie w zimnie i w ciemności powoduje powstanie biogennych stymulatorów w tkankach roślinnych, odpowiedzialnych za efekty terapeutyczne (8). Po okresie bioaktywacji, rozdrobnione liście poddaje się ekstrakcji wodą redestylowaną, na drodze gotowania przez okres 10-20 min. Ekstrakty wodne po filtracji i sterylizacji są ampułkowane i wyjaławiane.
Biostymina stosowana jest najczęściej w profilaktyce i leczeniu zakażeń górnych dróg oddechowych (1, 4, 6). Warto zaznaczyć, że działanie immunostymulujące Biostyminy zależne jest od dawki i drogi podania.
Cel pracy
Celem pracy jest potwierdzenie immunostymulującego działania Biostyminy otrzymywanej w aktualnym procesie wytwarzania i porównanie jej działania z aktywnością syntetycznych immunostymulatorów. Do oceny działania immunostymulującego zastosowano testy: cytotoksyczności z hydrokortyzonem i rozetowy, przy czym prawidłowe przeprowadzenie immunizacji zwierząt sprawdzano za pomocą testu hemaglutynacji.
Materiały i metody
Zwierzęta
Myszy szczepu wsobnego Balb-c, samice, w wieku 4 tyg. o masie ciała ok. 16 g (test cytotoksyczności) oraz 6-8 tyg. o masie ciała ok. 20 g (test tworzenia rozet E i test hemaglutynacji czynnej). Zwierzęta pozyskiwano z hodowli Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny. Doświadczenia z udziałem zwierząt wykonano za zgodą IV Lokalnej Komisji Etycznej; nr 47/2013 (06/NIL/2010).
Płyny hodowlane
– Podłoże hodowlane RPMI-1640, z dodatkiem Hepes 20 mM/l (IITD Wrocław);
– Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej, PBS (IITD Wrocław);
– Płyn Hanksa z dodatkiem 0,5% hydrolizatu laktoalbuminy (IITD Wrocław).
Odczynniki
– Hydrokortyzon – (Corhydron) 100 mg, proszek i rozpuszczalnik (Jelfa);
– Krwinki czerwone owcy (SRBC), GRASO Biotech, stabilizowane w płynie Alsewera;
– Płyn Alsewera: glukoza, cytrynian sodu, chlorek sodu, kwas cytrynowy (wszystkie odczynniki POCH);
– Izofluran – (AErrane), płyn (Baxter); Surowica cielęca płodowa (Bioprodukt); Błękit trypanu, substancja (Merck); Fiolet krystaliczny, substancja (Merck); Gradisol L o gęstości 1,077 g/ml (Aqua Medica).
Immunostymulatory
– Biostymina, płyn doustny (Phytopharm, Klęka);
– Produkt leczniczy Biostymina podawano w teście cytotoksyczności, w dawkach: 2, 4, 6 i 8 μl/ml hodowli; w teście hemaglutynacji i rozetowym w dawkach: 2 i 4 μl/mysz (podanie doustne) (1);
– Isoprinosine, substancja (Synthelabo); Levamisole hydrochloride, substancja (Sigma). Oba związki stosowano w stężeniach: 1,00; 0,10 i 0,01 mg/ml hodowli (11).
Test cytotoksyczności
W teście oceniano wpływ danego czynnika na przeżywalność tymocytów myszy w 18-20 godz. hodowlach z hydrokortyzonem (12). Niedojrzałe tymocyty mają na swojej powierzchni receptory dla sterydów, przez co są wrażliwe na lityczne działanie hydrokortyzonu, który indukuje aktywny proces autodestrukcji i wywołuje apoptozę (13, 14). Podczas dojrzewania i nabywania przez limfocyty kompetencji immunologicznych, komórki tracą te receptory i stają się sterydooporne. Hodowle tymocytów są dobrym modelem doświadczalnym dla szybkiej oceny czynników mogących przyspieszać dojrzewanie limfocytów T, a więc wywierających działanie tymomimetyczne, podobne do działania hormonów grasicy.
Myszy usypiano izofluranem i pobierano jałowo grasice, które następnie przecierano przez metalowe sito (średnica oczek około 300 μm, produkcji firmy Sigma). Tymocyty otrzymane z rozdrobnionych grasic przepłukiwano trzykrotnie RPMI-1640 i wirowano (1800 obr./min przez 7-8 min). Po ostatnim wirowaniu tymocyty w liczbie 4x106 komórek/ml zawieszano w RPMI z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej. Zawiesinę tymocytów rozlewano po 1 ml do jałowych probówek i dodawano po 2, 4, 6 lub 8 μl Biostyminy lub lewamizol i izoprynozynę w stężeniu: 1,00; 0,10 i 0,01 mg/ml. Po upływie 1 godz. dodawano hydrokortyzon w dawce 50 μg/ml hodowli tymocytów. Tak przygotowane próby inkubowano przez 18-20 godz. w temp. 37°C w atmosferze CO2. Po tym czasie obliczano dla każdej hodowli liczbę żywych i martwych komórek po zabarwieniu 0,04% roztworem błękitu trypanu. Test przeprowadzano w warunkach jałowych.
Warunkiem prawidłowo przeprowadzonego doświadczenia jest odpowiednia żywotność tymocytów. Pod mikroskopem liczono 100 komórek, oddzielnie żywe i martwe. Odsetek komórek żywych w kontroli bez hydrokortyzonu powinien wynosić powyżej 80%; w przeprowadzonych badaniach żywotność tymocytów w hodowlach kontrolnych wynosiła od 86,3-91,3%. Względna przeżywalność komórek (stosunek komórek żywych w hodowli z hydrokortyzonem do komórek żywych w kontroli powinien mieścić się w granicach 50-65%) wynosiła średnio 56,93% (względna przeżywalność komórek poniżej 50% lub powyżej 65% dyskwalifikuje doświadczenie). Wyniki przeliczano jako procentowy wzrost (lub spadek) liczby żywych komórek w hodowlach z badanymi czynnikami w stosunku do hodowli z hydrokortyzonem.
Test rozetowy
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Białas-Chromiec B, Skopińska-Różewska E, Strzelecka H i wsp. Immunomodulujące właściwości Biostyminy – wodnego wyciągu z liści roślin trzyletnich Aloe arborescens Mill. Onkol Pol 2000; 3(2):85-9. 2. Jia Y, Zhao G, Jia J. Preliminary evaluation: The effects of Aloe ferox Miller and Aloe arborescens Miller on wound healing. J Ethnopharmacol 2008; 120(2):181-9. 3. Demkow U, Skopińska-Różewska E. Wpływ preparatu Bioaron C na odporność. [W:] Rola immunomodulatorów pochodzenia naturalnego w zapobieganiu i leczeniu chorób (red. E. Skopińska-Różewska, AK Siwicki). Wyd Medyk 2003; 51-56. 4. Glatthaar-Saalmüller B, Michalak A, Bastion P i wsp. Ocena aktywności przeciwwirusowej in vitro preparatów Biostymina i Bioaron C względem ludzkiego rinowirusa (HRV14). Post Fitoter 2012; (3):156-61. 5. Rekiel A, Belga K, Kuczyńska B. Wpływ wybranych immunomodulatorów na wskaźniki fizjologiczno-produkcyjne u loch. J Centr Eur Agric 2008; 9(2):329-36. 6. Furowicz AJ, Czernomysy-Furowicz D, Lewandowska S. Wykorzystanie Biostyminy w terapii i profilaktyce bronchopneumonii cieląt. Przegl Hodowl 1989; (9):10-5. 7. Budny A, Kupczyński R, Sobolewska S i wsp. Samolecznictwo i ziołolecznictwo w profilaktyce i leczeniu zwierząt gospodarskich. Acta Sci Pol Med Vet 2012; 11(1):5-24. 8. Białas-Chromiec B. Immunotropowe działanie aloesu. [W:] Wpływ substancji naturalnych na układ odpornościowy (red. E. Skopińska-Różewska). Fund Prom Zdrowia – Med Nat 2002; 43-52. 9. Beppu H, Shimpo K, Chihara T i wsp. Antidiabetic effects of dietary administration of Aloe arborescens Miller components on multiplex low-dose streptozotocin-induced diabetes in mice investigation on hypoglycemic action and systemic absorption dynamics aloe components. J Ethnopharmacol 2006; 103(3):468-77. 10. Lissoni P, Rovelli F, Brivio F i wsp. A randomized study of chemotherapy versus biochemotherapy with chemotherapy plus Aloe arborescens in patients with metastatic cancer. In Vivo 2009; 23(1):171-5. 11. Drozd J, Tautt J. Badania porównawcze aktywności immunostymulującej Fructus Myrtilli ze związkami o ustalonym działaniu na układ odpornościowy. Biul Inst Lek 2002; 46(1-2):43-8. 12. Trainin N, Levo Y, Rotter V. Resistance to hydrocortisone conferred upon thymocytes by a thymic humoral factor. J Immunol 1974; (4):634-7. 13. Fearnhead HO, Chwaliński M, Snowden RT i wsp. Dexamethasone and etoposide induce apoptosis in rat thymocytes from different phase of the cell cycle. Biochem Pharmacol 1994; 48:1073-9. 14. Ahmed SA, Sriranga N. Differential effects of dexamethasone on the thymus and spleen: alternation programmed cell death, lymphocyte subsets and activation of T cells. Immunopharmacol 1994; 28:55-66. 15. Kuratowska Z, Lutyński A, Dwilewicz-Trojaczek J. Wybrane zagadnienia immunologii klinicznej. PZWL, Warszawa 1982. 16. Bach JG, Dardenne M. Antigen recognition by T lymphocytes. Cell Immunol 1972; 3(1):1-21. 17. Adler FL. Studies on mouse antibodies. I. The response to sheep red cells. J Immunol 1965; 95:26-38. 18. Sawicka T, Prosińska J, Drozd J. Wpływ wybranych kwasów porostowych na odpowiedź komórkową i humoralną układu immunologicznego myszy. Biul Inst Lek 1997; 41:17-24. 19. Gutterman Y, Chauser-Volfson E. The distribution of the phenolic metabolites barbaloin, aloeresin and aloenin as a peripheral defense strategy in the succulent leaf parts of Aloe arborescens. Biochem Syst Ecol 2000; 28(9):825-38. 20. Coopoosamy RM, Naidoo KK. A comparative study of three Aloe species used to treat skin diseases in South African rural communities. J Altern Complement Med 2013; 19(5):425-8. 21. Beppu H, Koike T, Shimpo K i wsp. Radical-scavenging effects of Aloe arborescens Miller on prevention of pancreatic inlet B-cell destruction in rats. J Ethnopharmacol 2003; 89:37-45. 22. Kucharska E. Wpływ Biostyminy na niektóre procesy immunologiczne. Ann Acad Med 1980; 26:369-86. 23. Roge A, Kość A, Warwas M. Przydatność w leczeniu i mechanizmy działania aloesu – współczesne poglądy. Farm Pol 2000; 56(8):381-5.
