© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 4/2015, s. 255-260
*Sylwia Brzezińska1, Małgorzata Szołkowska2, Renata Langfort2, Zofia Zwolska1, Ewa Augustynowicz-Kopeć1
Wykrywanie prątków Mycobacterium tuberculosis complex w materiałach tkankowych utrwalonych w parafinie
Detection of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-embedded tissue specimens
1Zakład Mikrobiologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Ewa Augustynowicz-Kopeć
2Zakład Patomorfologii, Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc, Warszawa
Kierownik Zakładu: prof. nadzw. dr hab. med. Renata Langfort
Streszczenie
Wstęp. Molekularne metody diagnostyczne umożliwiają wykrywanie materiału genetycznego M. tuberculosis complex bezpośrednio w materiałach klinicznych. Metody te zastosowano również w diagnostyce materiałów pooperacyjnych, utrwalonych w parafinie. Potwierdzenie bądź wykluczenie obecności materiału genetycznego Mycobacterium tuberculosis complex w preparatach histopatologicznych jest szczególnie istotne w przypadku pacjentów, których diagnostyka gruźlicy opiera się wyłącznie na materiałach tkankowych, niepoddanych badaniom mikrobiologicznym.
Cel pracy. Celem przeprowadzonych badań była ocena przydatności metod genetycznych do wykrywania Mycobacterium tuberculosis complex, w materiałach klinicznych utrwalonych w parafinie.
Materiał i metody. Analizowano 63 materiały tkankowe, utrwalone w parafinie, uzyskane od chorych z podejrzeniem gruźlicy. Diagnostykę wykonywano według następującego algorytmu: 1. Odparafinowanie preparatów z użyciem ksylenu, odwodnienie przy użyciu etanolu. 2. Izolowanie DNA za pomocą odpowiedniego zestawu przeznaczonego do materiałów tkankowych utrwalonych w parafinie. 3. BD ProbeTec. Amplifikacja DNA Mycobacterium, hybrydyzacja z odpowiednią dla gatunku sondą. Wykrywana jest sekwencja IS6110 charakterystyczna dla M. tuberculosis complex. 4. GeneXpert Dx Xpert MTB/RIF oparty na reakcji nested Real-time PCR. Test Xpert MTB/RIF jest stosowany do wykrywania Mycobacterium tuberculosis i oporności na RMP.
Wyniki. Analiza molekularna wykazała obecność DNA M. tuberculosis w 21 materiałach, przy czym za pomocą barwienia Ziehl-Neelsen potwierdzono ją jedynie w 13 materiałach. Wynik barwienia Z-N był ujemny u 41 pacjentów, u 33 z nich wynik był zgodny z ujemnym wynikiem testu genetycznego.
Wnioski. Metody molekularne pozwalają uzupełnić i zweryfikować wyniki mikrobiologiczne i histopatologiczne.
Summary
Introduction. Molecular methods of diagnosis enabled the detection of M. tuberculosis complex directly in clinical materials, now make it possible also in the tissue embedded in paraffin blocks. Use of molecular methods to confirm the presence of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-fixed material is particularly important for patients whose diagnosis based solely on the tissue and were not microbiologically tested.
Aim. The aim of the research was to evaluate the usefulness of genetic methods to confirm the presence of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical specimens on paraffin.
Material and methods. 63 clinical specimens embedded in paraffin from patients with suspected tuberculosis. 1. Deparaffinization of specimens in xylene and dehydration in 96% ethanol by succeesive centrifugation. 2. Isolation DNA with the appropriate set to tissues embedded in paraffin blocks. 3. BD ProbeTec: The ampliflcation (in microwell) of Mycobacterium DNA, detection of the copied deoxyribonucleic acid in the process of the hybridization with species probe. Detected is insertion sequence IS6110 characteristic for the group M. tuberculosis complex. 4. GeneXpert Dx Test Xpert MTB/RIF is based on the reaction of nested real-time PCR. Test Xpert MTB/RIF is used to detect Mycobacterium tuberculosis and resistance to RMP.
Results. The molecular analysis revealed the presence of M. tuberculosis complex DNA in 21 samples, whereas acid fast bacilli could be detected by Ziehl-Neelsen staining in only 13 samples. Z-N was negative in 41 of the patients, for 33 of them the result was compatible with the negative genetic test.
Conclusions. Molecular methods are very important to complement and verify the microbiological and pathological results.
Wstęp
Mikrobiologiczna diagnostyka Mycobacterium w znacznym stopniu odbiega od typowej diagnostyki bakteriologicznej. Różnice te wynikają przede wszystkim ze specyficznych cech Mycobacterium, takich jak: długi czas wzrostu (komórka prątka dzieli się raz na 24 h), budowa ściany komórkowej, skład, którego nawet w 60% mogą stanowić lipidy. Hydrofobowy charakter ściany komórkowej prątków zapewnia im ochronę przed wysuszeniem, niekorzystnymi wartościami pH oraz podwyższoną temperaturą (1).
Prątki posiadają specyficzne wymagania wzrostowe, w związku z tym pożywki hodowlane muszą zawierać optymalne zestawy wszystkich koniecznych substancji wzrostowych, być wzbogacone białkiem zwierzęcym i pirogronianem lub glicerolem jako źródłem węgla (2).
Czynniki te powodują, że w zależności od zastosowanej metody diagnostycznej czas oczekiwania na wyniki badań trwa od jednego dnia (metody molekularne i rozmaz) do nawet 10 tygodni (uzyskanie hodowli na jajowej pożywce stałej L-J).
Rozwój biologii molekularnej i opracowanie testów opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych pozwoliły na skrócenie czasu oczekiwania na wyniki badań diagnostycznych. Wykorzystanie unikalnych sekwencji nukleotydowych Mycobacterium umożliwiło wykrywanie obecności prątków w materiale klinicznym z większą czułością niż przy zastosowaniu bakterioskopii i w znacznie krótszym czasie niż w metodach hodowlanych. Badania molekularne znalazły zastosowanie w wykrywaniu materiału genetycznego prątków od chorych z podejrzeniem gruźlicy płuc, a także z podejrzeniem postaci pozapłucnych, u których ze względu na skąpoprątkowy charakter materiałów diagnostycznych trudno jest uzyskać potwierdzenie procesu chorobowego standardowymi metodami mikrobiologicznymi. Testy genetyczne stosowane w rutynowej diagnostyce gruźlicy charakteryzują się wysoką czułością, ponieważ do stwierdzenia obecności prątków wystarczy 5 x 10-102 komórek bakteryjnych w 1 ml materiału, natomiast do uzyskania hodowli na pożywce L-J potrzeba aż 103-104 komórek prątków w 1 ml materiału.
Często materiały skąpoprątkowe (np. fragmenty tkanek lub materiały biopsyjne) od chorego kierowane są tylko do badań patomorfologicznych. Wynik tych badań uzyskuje się w krótszym czasie niż wynik posiewu, co u chorego z podejrzeniem gruźlicy pozwala na szybką weryfikację diagnozy klinicznej, nie gwarantując jednak pewnego rozpoznania choroby (3). W materiale tkankowym, z którego wykonywane są preparaty histopatologiczne, rozpoznanie opiera się na obecności różnie uformowanych ziarniniaków, zbudowanych z komórek nabłonkowatych i olbrzymich, często z kwasochłonną martwicą w części centralnej (4). Obraz morfologiczny gruźlicy może być jednak różny, zależnie od stopnia upośledzenia układu odpornościowego. W ciężkich zaburzeniach odporności trudno jest znaleźć typowe ziarniniaki (5). Pojawiają się natomiast rozlane obszary martwicy kwasochłonnej, niespecyficzne nacieki zapalne, zawierające histiocyty, często o jasnej cytoplazmie, granulocyty obojętnochłonne, pojedyncze komórki olbrzymie i nabłonkowate (4). Jednak tworzenie się ziarniniaków nie jest specyficzne dla określonej jednostki chorobowej i może występować w stanach patologicznych, takich jak: gruźlica, sarkoidoza, mykobakterioza, bruceloza, choroba kociego pazura, ziarniniakowatość Wegenera czy grzybica (6).
Dlatego u chorego z podejrzeniem gruźlicy stwierdzenie ziarniniaków, nawet z martwicą, nie jest równoznaczne z rozpoznaniem choroby i wymaga diagnostyki mikrobiologicznej, umożliwiającej wykrycie prątków kwasoopornych w obrębie obserwowanych zmian morfologicznych.
W tym celu konieczne jest wykonanie barwienia preparatu metodą Ziehla-Neelsena (Z-N). Zalecane jest barwienie dwóch skrawków mikroskopowych, pobranych z różnych fragmentów materiału, w których obserwuje się ziarniniaki z martwicą i rozmiękaniem (4). Metoda Z-N charakteryzuje się jednak niską czułością, ocenianą, w zależności od autorów, na 30-70% (2). Ponadto w badaniu tym nie można odróżnić prątków gruźlicy od prątków atypowych MOTT (ang. Mycobacterium Other Than Tuberculosis). W przypadku potwierdzenia, w wyniku barwienia Z-N, obecności prątków w preparatach histopatologicznych, należy wykonać posiew świeżego materiału klinicznego. Dla uzyskanej hodowli niezbędne jest wykonanie testu identyfikacji gatunkowej i lekowrażliwości. Z uwagi na fakt, że nie każdy materiał pooperacyjny jest skierowany do badania mikrobiologicznego, najczęściej jedyną metodą wykrycia prątków M. tuberculosis w preparatach histopatologicznych pozostaje badanie genetyczne.
Techniki molekularne umożliwiają szybką (w ciągu kilku godzin) amplifikację wybranych odcinków genomu bakteryjnego w ilości, jaka jest wymagana do hybrydyzacji ze specyficzną sondą genetyczną. W diagnostyce gruźlicy metody te umożliwiają wykrycie M. tuberculosis complex bezpośrednio w materiałach klinicznych, a przy wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji metodologicznych również w materiałach tkankowych zatopionych w bloczkach parafinowych. Zatem w przypadku chorego z podejrzeniem gruźlicy, dla którego wykonano jedynie badanie histopatologiczne, test genetyczny jest kluczowym badaniem umożliwiającym potwierdzenie procesu chorobowego.
Cel pracy
Celem pracy była ocena przydatności metod molekularnych w wykrywaniu materiału genetycznego prątków w preparatach histopatologicznych, pochodzących od chorych z podejrzeniem gruźlicy oraz określenie korelacji między wynikiem badania genetycznego, histopatologicznego oraz badaniem bakterioskopowym.
Materiał i metody
Analizie poddano materiały tkankowe utrwalone w parafinie, uzyskane od 63 chorych z klinicznym podejrzeniem gruźlicy. W opisach wszystkich preparatów histopatologicznych stwierdzono zmiany zapalne, organizujące się ziarniniaki, zwłóknienia bądź inne zmiany charakterystyczne dla procesu zapalnego.
Wykrywanie materiału genetycznego M. tuberculosis complex przeprowadzono w systemie ProbeTec i w systemie GeneXpert, dodatkowo określającym oporność prątków na RMP.
Metodyka wykonywania preparatów histopatologicznych
1. Pobieranie materiału tkankowego i jego utrwalenie.
Uniwersalnym i najczęściej stosowanym utrwalaczem jest 10% wodny roztwór formaldehydu, zobojętnionego węglanem wapnia. Czas utrwalania jest uzależniony od rodzaju utrwalacza, tkanki i techniki barwienia i zwykle wynosi ok. 12 h.
2. Odwadnianie i zatapianie preparatu w parafinie.
Dzięki procesowi zatapiania fragmentów tkanek w twardym i łatwo skrawalnym materiale, możliwe jest uzyskanie z nich bardzo cienkich skrawków.
Proces odwadniania przeprowadzany jest poprzez umieszczanie tkanki w roztworach etanolu o wzrastającym stężeniu, począwszy od alkoholu 50% poprzez 70%, 80%, 90%, 96% do alkoholu absolutnego (99,8%), a następnie w mieszaninie alkohol-ksylen i czystym ksylenie. Jest to tzw. szereg odwadniający. Kolejny etap polega na umieszczeniu tkanki w mieszaninie parafiny z ksylenem i ciekłej parafinie (w temp. 52°C przez kilkanaście godzin). Tak przygotowany materiał umieszcza się we wnętrzu bloczka parafinowego, a następnie kroi za pomocą mikrotomu na skrawki o grubości kilku μm i nakłada na szkiełko podstawowe (silanizowane lub nabiałkowane), utrwalając w temperaturze 50°C.
3. Barwienie preparatu.
Po uprzednim odparafinowaniu preparatów w dwóch zmianach ksylenu poddaje się je procesowi nawodnienia. Nawodnienie przeprowadza się w szeregu alkoholowym, złożonym z roztworów etanolu, począwszy od alkoholu absolutnego do alkoholu 70%. Następnie skrawki poddawane są płukaniu w wodzie i umieszczane w roztworach barwników. Najczęściej używanymi barwnikami są hematoksylina i eozyna.
W badaniu histopatologicznym, mającym na celu wykrywanie Mycobacterium, zazwyczaj obserwuje się obecność zmian o charakterze ziarniny. W przypadku obecności w preparacie takich zmian, w celu potwierdzenia obecności prątków, wykonywane jest dodatkowe barwienie (Z-N), wykorzystujące kwasooporność Mycobacterium.
Metodyka opracowania preparatu histopatologicznego do badania genetycznego
Izolacja materiału genetycznego prątków z preparatów histopatologicznych została przeprowadzona metodą automatyczną, z zastosowaniem aparatu Maxwell MDx (Promega) oraz metodą manualną.
Izolacja DNA w systemie Maxwell MDx
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Fol M, Olek J, Kowalewicz-Kulbat M et al.: Prątki niegruźlicze: M. marinum, M. ulcerans, M. xenopi – krótka charakterystyka drobnoustrojów i zmian klinicznych przez nie wywoływanych. Postepy Hig Med Dośw 2011; 65: 574-583.
2. Augustynowicz-Kopeć W, Zwolska Z: Postępy w diagnostyce i epidemiologii molekularnej Mycobacterium tuberculosis. Post Mikrobiol 2010; 49(3): 151-156.
3. Hillemann D, Galle J, Vollmer E et al.: Real-time assay for improved detection of Mycobacterium tuberculosis complex in paraffin-embedded tissues. Int J Tuberc Lung Dis 2006; 10(3): 340-342.
4. Tomashefski JF Jr, Farver CF: Tuberculosis and nontuberculous mycobacterial infections. [In:] Tomashefski JF Jr, Cagle PT, Farver CF, Fraire AE (eds.): Dail and Hammar’s pulmonary pathology. 3rd ed. Springer, New York 2008: 316-348.
5. Jagirdar J: Mycobacterial diseases. [In:] Zander DS, Farver CF (eds.): Pulmonary pathology. Churchill Livingstone 2008: 204-218.
6. Negi M, Takemura T, Guzman J et al.: Localization of Propionibacterium acnes in granulomas supports a possible etiologic link between sarcoidosis and the bacterium. Mod Pathol 2012 Sep; 25(9): 1284-1297.
7. Johansen IS, Thomsen V, Forsgren A et al.: Detection of Mycobacterium tuberculosis complex in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens with necrotizing granulomatous inflammation by strand displacement amplification. Journal of Mol Diagn 2004; 6(3): 231-236.
8. Zink AR, Nerlich AG: Molecular strain identification of the Mycobacterium tuberculosis complex in archival tissue samples. J Clin Pathol 2004; 57(11): 1185-1192.
9. Augustynowicz-Kopec E, Jagielski T, Kozińska M, Zabost A: The significance of spoligotyping method in epidemiological investigation of tuberculosis. Pnemonol Alergol Pol 2007; 75(1): 22-31.
10. Michałowska-Mitczuk D, Brzezińska S, Augustynowicz-Kopeć E et al.: Granuloma of epididymis of ptient treated with intravescial BCG therapy – complication. Pneumonol Alergol Pol 2011; 79(4): 305-308.
11. Min KW, Ko JY, Park ChK: Histopathological spectrum of cutaneous tuberculosis and non-tuberculous mycobacterial infections. J Cutan Pathol 2012; 39(6): 582-595.
12. Munkhdelger J, Wang H-Y, Choi Y et al.: Identification of Mycobacterium species in FFPE granulomatous lymphadenitis tissue using REBA Myco-ID. Int J Tuberc Lung Dis 2013: 1-5.
13. Barcelos D, Franco MF, Leao SC: Effects of tissue handling and processing steps on PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed paraffin-embedded samples. Rev Inst Med Trop S Paolo 2008; 50(6): 321-326.
