© Borgis - Postępy Nauk Medycznych 4b/2015, s. 10-15
Emilia Tsimbalari1, *Beata Sulik-Tyszka2, Marlena Gołaś2, 3, Magdalena Sikora4, Katarzyna Piskorska2, 3, Ewa Swoboda-Kopeć2, 3
Analiza pokrewieństwa genetycznego szczepów C. glabrata opornych na leki z grupy azoli wyizolowanych z materiałów klinicznych chorych hospitalizowanych w Samodzielnym Publicznym Centralnym Szpitalu Klinicznym
Genetic relatedness of resistant C. glabrata strains to azoles isolated from clinical specimens of patients hospitalized in Central Clinical Hospital
1Katedra Mikrobiologii, Wirusologii i Immunologii, Państwowy Uniwersytet Medyczny i Farmaceutyczny im. N. Testemicanu, Kiszyniów, Mołdawia
Kierownik Katedry: prof. dr. hab. med. Valeriu Rudic
2Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny, Warszawa
P.o. Kierownika Zakładu: dr hab. n. med. Marta Wróblewska
3Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa
Kierownik Zakładu: prof. nadzw. dr hab. med. Grażyna Młynarczyk
4Zakład Mikrobiologii Stomatologicznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa
P.o. Kierownika Zakładu: dr hab. n. med. Marta Wróblewska
Streszczenie
Wstęp. W ostatnich latach odnotowano znaczący postęp w diagnostyce zakażeń grzybiczych spowodowany przede wszystkim opracowaniem nowych metod diagnostycznych oraz wprowadzeniem metod opartych na biologii molekularnej. Metody te są stosowane zarówno do diagnostyki, jak i badań epidemiologicznych. Jedną z ostatnich modyfikacji metody genetycznej RAPD PCR jest PCR melting profile. Metoda ta posiada wyższy potencjał różnicujący, w porównaniu z metodą RAPD PCR, dzięki wystandaryzowaniu poszczególnych etapów reakcji.
Cel pracy. Analiza pokrewieństwa gentycznego szczepów C. glabrata opornych na leki z grupy azoli wyizolowanych z materiałów klinicznych chorych hospitalizowanych w Samodzielnym Publicznym Centralnym Szpitalu Klinicznym (SPCSK) w Warszawie.
Materiał i metody. Analizie poddano 54 szczepy C. glabrata wykazujące oporność na leki z grupy azoli. Szczepy zostały wyizolowane z różnych materiałów klinicznych od chorych z zakażeniem inwazyjnym zgodnie z zasadami klasycznej diagnostyki mikologicznej. Badanie pokrewieństwa genetycznego wykonano używając komercyjnego zestawy PCR MP.
Wyniki. Dla 54 szczepów C. glabrata wykonano analizę ich pokrewieństwa genetycznego. Na podstawie porównania wzorów prążkowych wyodrębniono 38 różnych typów genetycznych. Od dwóch chorych wyizolowano szczepy C. glabarata o tym samym wzorze prążkowym.
Wnioski. Duże zróżnicowanie wyizolowanych szczepów może świadczyć o endogennym charakterze większości zakażeń i wyklucza możliwość klonalnego rozprzestrzeniania się szczepów C. glabrata w środowisku szpitalnym.
Summary
Introduction. In the last years there has been significant progress in the diagnostics of fungal infections which is associated with the development of new diagnostic methods and the development of methods based on molecular biology. These methods are used for both, diagnostic and epidemiological studies. One of the last modification of the RAPD method is PCR melting profile, this method differentiate microorganisms at the same level or even better than the RAPD.
Aim. Genetic relatedness analysis of C. glabrata strains resistant to azoles isolated from clinical samples patients hospitalized in the Central Clinical Hospital in Warsaw.
Material and methods. 54 strains of C. glabrata resistant to azoles were analyzed. The strains were isolated from various clinical materials patients with invasive infections in accordance using rutine mycological techniques. The study of genetic relatedness was performed using a commercial PCR MP kits.
Results. Fifty-four strains of C. glabrata strains were for genetic relatedness. On the basis of bands patterns 38 different genetic types were identified. In one case, from two patients were isolated C. glabrata strains with the same band patterns.
Conclusions. High diversity of C. glabrata strains may be indicative of an endogenous nature of most infections and rule out the possibility of clonal spread of strains in a hospital environment.
Wstęp
W ostatnich latach częstość zakażeń oportunistycznych o etiologii grzybiczej wykazuje tendencję wzrostową. Związane jest to ze zwiększającą się liczbą osób z obniżoną odpornością. Najczęstszym czynnikiem etiologicznym pozostają nadal grzyby z rodzaju Candida. Odnotowuje się wzrost częstości zakażeń wywołanych przez szczepy lekooporne oraz nowe gatunki grzybów. Rozpoznanie grzybicy powinno opierać się na obrazie klinicznym chorego oraz badaniach mikologicznych, serologicznych, molekularnych i histopatologicznych. W dużej liczbie przypadków inwazyjnych zakażeń grzybiczych leczenie empiryczne powinno być włączone na podstawie obrazu klinicznego chorego i badań obrazowych, ponieważ diagnostyka uogólnionych zakażeń grzybiczych jest niezwykle trudna. Zakażenia grzybicze rozpoznawane są tylko w 20-30% przypadków za życia chorego. Obraz kliniczny układowych zakażeń grzybiczych jest mało charakterystyczny, może być podobny do zakażeń o etiologii wirusowej, jak również bakteryjnej. Do najczęstszych objawów klinicznych zakażenia grzybiczego należy gorączka. Utrzymywanie się stanów gorączkowych u chorego leczonego antybiotykami szerokospektralnymi, szczególnie z upośledzeniem odporności, powinno nasuwać podejrzenie zakażenia grzybiczego (1-3).
Inwazyjne zakażenia grzybicze to głównie zakażenia szpitalne wywołane przez grzyby z rodzaju Candida i Aspegillus. Szacuje się, że liczba zakażeń szpitalnych waha się od 5-10%, śmiertelność w przypadku bakteriemii wynosi 16%, natomiast w przypadku fungemii od 30-81%. Drożdżaki z rodzaju Candida są czwartym co do częstości czynnikiem etiologicznym zakażeń łożyska naczyniowego. W latach 1979-2000 liczba rejestrowanych fungemii wzrosła o ponad 200% (4, 5). Najczęstszym czynnikiem etiologicznym fungemii były: C. albicans (47,9-58,4% przypadków), C. glabrata, C. parapsilosis i C. tropicalis. Inne gatunki: C. krusei, C. lusitaniae, C. guilermondii, C. dubliniensis, Saccharomyces były wykrywane dużo rzadziej.
Leczenie zakażeń grzybiczych, mimo znaczącego postępu, pozostaje nadal poważnym problemem i bywa znacznie trudniejsze niż leczenie zakażeń bakteryjnych. Wpływa na to niewielka liczba antymikotyków w porównaniu z liczbą leków antybakteryjnych, ale przede wszystkim specyfika procesu infekcyjnego i rozpoznawanie zakażeń grzybiczych zwłaszcza u osób z zaburzeniami układu odpornościowego. Obraz kliniczny układowych zakażeń grzybiczych nie jest charakterystyczny. W każdym przypadku prawdopodobnej infekcji grzybiczej konieczne jest ustalenie czynnika etiologicznego, oznaczenie jego lekowrażliwości i monitorowanie skuteczności leczenia odpowiednim antymikotykiem (6).
Strategia terapii w tej grupie chorych obejmuje leczenie profilaktyczne, empiryczne i celowane. Wybór opcji terapeutycznej powinien być oparty na ocenie wystąpienia czynnika ryzyka zakażenia grzybiczego, właściwym rozpoznaniu, ocenie stanu klinicznego pacjenta oraz badaniach diagnostycznych. Zbyt późne rozpoznanie, a także zbyt późne wdrożenie leczenia zmniejsza jego skuteczność (7). Trudności terapeutyczne wynikają z szybko narastającej lekooporności na leki przeciwgrzybicze. W związku z szeroko stosowaną profilaktyką rośnie częstość występowania szczepów opornych na standardowe leczenie antymikotykami.
Rozwój biologii molekularnej umożliwił wykorzystanie markerów molekularnych w diagnostyce mikologicznej. Metody te charakteryzują się wysoką czułością i specyficznością.
W ciągu ostatnich lat metody molekularne znalazły zastosowanie w badaniach pokrewieństwa genetycznego. Szeroko stosowaną metodą typowania genetycznego jest RAPD (ang. random amplification of polymorphic DNA). Jedną z ostatnich modyfikacji metody RAPD jest metoda PCR melting profile, opracowana przez Masny i Płucienniczaka. Różnicuje ona drobnoustroje lepiej niż technika molekularna RAPD. Dodatkowo jest prosta w wykonaniu, tania i możliwa do przeprowadzenia w krótkim czasie (8, 9).
Metoda typowania MP PCR (ang. melting profile PCR) została zmodyfikowana i zoptymalizowana przez Krawczyk i wsp. (9). Technika ta opiera się na analizie DNA genomowego poddawanego reakcji trawienia przy zastosowaniu jednego enzymu restrykcyjnego. W kolejnym etapie powstałe fragmenty restrykcyjne ligowane są z adaptorem. Powstała mieszanina ligacyjna stanowi matrycę w reakcji PCR. Różnicowanie badanych izolatów oparte jest na amplifikacji ograniczonej liczby fragmentów przy zastosowaniu obniżonej temperatury denaturacji w reakcji PCR, zależnej od analizowanego drobnoustroju. Technika MP PCR (melting profile PCR) wykorzystywana jest w badaniach epidemiologicznych stosowanych w przypadku szpitalnych zakażeń grzybiczych, w celu określenia ich transmisji. Badania te również pozwalają na monitorowanie leczenia przeciwgrzybiczego pod kontem zmienności drobnoustrojów i ich oporności na antymikotyki (10-16).
Cel pracy
Analiza pokrewieństwa gentycznego szczepów C. glabrata opornych na leki z grupy azoli wyizolowanych z materiałów klinicznych chorych hospitalizowanych w Samodzielnym Publicznym Centralnym Szpitalu Klinicznym (SPCSK) w Warszawie.
Materiał i metody
Materiał do badania stanowiło 189 szczepów grzybów drożdżopodobnych z gatunku Candida glabrata wyizolowane od 110 chorych z zakażeniem inwazyjnym hospitalizowanych w Oddziałach Zabiegowych, Zachowawczych i w Oddziale Intensywnej Terapii w ramach rutynowej diagnostyki mikologicznej, w Centralnym Szpitalu Klinicznym w Warszawie w latach 2008-2010. Spośród szczepów do badania wybrano 54 szczepy C. glabrata wykazujące oporność na leki z grupy azoli.
Oznaczanie wartości MIC antymikotyków wykonano metodą E-test (bioMerieux) z zastosowaniem podłoża RPMI-agar (Biomed). Inkubację prowadzano w wilgotnym inkubatorze w temp. 35°C w ciągu 24-48 godzin (aż do uzyskania wzrostu).
Odczytów dokonywano według zaleceń zawartych w instrukcji „E-test AB BIODISK”.
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Zielińska E: Kontrowersje dotyczące optymalnej profilaktyki i leczenia zakażeń grzybami w stanach obniżonej odporności. Przegl Epidemiol 2003; 57: 299-307.
2. Seferyńska I, Pałynyczko G, Warzocha K: Układowe zakażenia grzybicze: etiologia, rozpoznanie i nowe możliwości lecznicze. Acta Haematol Pol 2005; 36(1): 45-54.
3. Swoboda-Kopeć E: Grzyby jako zagrażające patogeny oddziałów szpitalnych. Rozprawa habilitacyjna, 2007.
4. Marchlik WD, Kurnatowski P: Grzyby jako czynniki etiologiczne zakażeń szpitalnych. Otolaryngologia 2010; 9(2): 50-54.
5. Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM et al.: Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24, 179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis 2004; 39: 309-317.
6. Biliński P, Seferyńska I, Warzocha K: Diagnostyka i leczenie układowych zakażeń grzybiczych w onkohematologii. Onkologia w Praktyce Klinicznej 2008; 4(1): 15-24.
7. Butrym A, Zywar K, Dzietczenia J, Mazur G: Inwazyjne zakażenia grzybicze u pacjentów z nowotworami hematologicznymi. Mikol Lek 2011; 18(1): 47-53.
8. Masny A, Płucienniczak A: Ligation mediated PCR performed at low denaturation temperatures – PCR melting profiles. Nucleic Acids Res 2003; 31(18): 114-119.
9. Krawczyk B, Leibner-Ciszak J, Mielech A et al.: PCR melting profile (PCR MP) – a new tool for differentiation of Candida albicans strains. BMC Infect Dis 2009; 9: 177-189.
10. Bartkowiak J: Zastosowanie metod biologii molekularnej w medycynie. [W:] Wierzbicki R (red.): Wybrane zagadnienia biologii molekularnej. Akademia Medyczna w Łodzi, 2000: 112-136.
11. Blumm HE, Wu CH, Wu GY (eds.): Molecular diagnosis and teraphy. Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, Boston, London 1996.
12. Bartkowiak J: Badania molekularne w rozpoznawaniu i różnicowaniu chorób zakaźnych. Przegl Epidemiol 2003; 57: 381-389.
13. Birmingham N, Luettich K: Polymerase chain reaction and its applications. Current Diagnostic Pathology 2003; 9: 159-164.
14. Bal J: Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Wyd. 2, PWN, Warszawa 2006.
15. Netsvyetayeva I, Sikora M, Gołoś M et al.: Diagnostyczne aspekty zakażeń grzybiczych u chorych po przeszczepieniu narządów unaczynionych (ze szczególnym uwzględnieniem przeszczepiania nerki). Nowa Klinika 2011; 18(4): 4079-4088.
16. White PL, Perry MD, Barnes RA: An update on the molecular diagnosis of invasive fungal disease. FEMS Microbiol Lett 2009; 296: 1-10.
17. Bean P, Olive DM: Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms. J Clin Microbiol 1999; 37: 1661-1669.
18. Pappas PG, Kauffman CA, Andes D et al.: Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Inf Dis 2009; 48: 503-535.
19. Nawrot U: Mikafungina – aktywność przeciwgrzybicza, zastosowanie w leczeniu i profilaktyce inwazyjnej kandydozy. Mikol Lek 2010; 17(1): 41-44.
20. Magill SS, Shields C, Sears CL et al.: Triazole Cross – Resistance among Candida spp.: Case Report, Occurrence among Bloodstream Isolates, and Implications for Antifungal Therapy. J Clinic Microbiol 2006; 44: 529-553.
21. Dorocka-Bobkowska B, Konopka K: Powstawanie biofilmu Candida i jego znaczenie w patogenezie zakażeń przewlekłych – przegląd piśmiennictwa. Dent Med Probl 2003; 40(2): 405-410.
22. Krajewska-Kułak E, Lewko J, Rolka H et al.: Grzybicze zakażenia szpitalne – narastający problem. Mikol Lek 2000; 7(3): 159-163.
23. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ et al.: In vitro susceptibility of invasive isolates of Candida spp. to anidulafungin, caspofungin, and micafungin: six years of Global Surveillance. J Clin Microb 2008; 46: 150-156.
24. Pfaller MA, Messer SA, Moet GJ et al.: Candida bloodstream infections: comparison of species distribution and resistance to echinocandin and azole antifungal agents in Intensive Care Unit (ICU) and non-ICU settings in the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2008-2009). International Journal of Antimicrobial Agents 2011; 38: 65-69.
25. Costa-de-Oliveira S, Marcos MI, Silva RM et al.: FKS2 mutations associated with decreased echinocandin susceptibility of Candida glabrata following anidulafungin therapy. Antimicrobial agents and chemiotherapy 2011; 55(3): 1312-1314.
26. Silva A, Costa-de-Oliveira S, Azevedo MM et al.: The increase of chitin content in the cell wall accounts for the reduced echinocandin susceptibility displayed by clinical isolates of C. parapsilosis. Clin Microbiol Infect 2010; 16(2): 215.
27. Marais E, Steward R, Duse AG et al.: Candida parapsilosis detected in TPN using the BactT: Alert system and characterized by randomly amplified polymorphic DNA. J Hosp Infect 2004; 56: 291-296.
