© Borgis - Anestezjologia Intensywna Terapia 2/2002, s. 71-75
Marcin Wąsowicz1,3, Henryk Jeleń2, Rafał Drwiła1,3, Janusz Andres1, Antoni Dziatkowiak4
Chromatograficzne pomiary zawartości pentanu, heksanu i ich pochodnych jako wykładnika oksydacji lipidów podczas operacji z użyciem krążenia pozaustrojowego (CPB)*
Serum pentane, hexane and their derivatives´ concentration as markers of lipid oxidation during cardiopulmonary bypass
1 Katedra Anestezjologii i Intensywnej Terapii;
kierownik: prof. dr hab. J. Andres – CM UJ w Krakowie
2 Zakład Koncentratów Spożywczych Wydziału Technologii Żywności;
kierownik: prof. dr hab E. Wąsowicz – Akademia Rolnicza w Poznaniu
3 Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, Oddział Intensywnej Terapii Kliniki Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii;
kierownik: doc. dr hab. J. Sadowski – CM UJ
4 Klinika Chirurgii Serca, Naczyń i Transplantologii;
kierownik: prof. dr hab. A. Dziatkowiak – CM UJ
Streszczenie
Pacjenci operowani z użyciem krążenia pozaustrojowego (ECC) częstokroć prezentują objawy ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej (SIRS), która może prowadzić do zaburzonego funkcjonowania wielu narządów. Istnieje wiele przyczyn odpowiedzialnych za powstawanie SIRS po zabiegach z użyciem krążenia pozaustrojowego (CPB) (tzw. post-pump syndrome), wiele z nich jest nie do końca zbadanych. Celem obecnej pracy jest analiza chromatograficzna (chromatografia gazowa fazy nadpowierzchniowej) utleniania lipidów podczas zabiegów pomostowania aortalno-wieńcowego z użyciem CPB. Po uzyskaniu akceptacji Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Jagiellońskiego oraz zgody pacjentów na uczestnictwo w badaniach zakwalifikowano do niego 20 osób w wieku od 39 do 74 l. Pacjenci ci byli poddani zabiegom pomostowania aortalno-wieńcowego. Znieczulenie, procedury chirurgiczne oraz metoda użyta podczas krążenia pozaustrojowego były zunifikowane we wszystkich przypadkach. Podczas zabiegu pięciokrotnie pobierano 8 ml próbki krwi – po indukcji znieczulenia (T0), 10 min po rozpoczęciu ECC (T1), 10 min. po zwolnieniu zacisku z aorty (Ao-Cx)(T2), 10 min po zakończeniu ECC (T3) oraz 1 h po zakończeniu ECC (T4). Po odwirowaniu próbek celem otrzymania osocza zamrażano je w -70oC. Utlenianie lipidów oznaczano metodą chromatografii gazowej fazy nadpowierzchniowej próbek osocza i mierzono jako powierzchnię zawartą pod odpowiednimi pikami otrzymanymi na chromatogramie. Analizy jakościowej pików dokonywano przy pomocy spektrometru masowego (Finnigan–Polaris, USA). Wyniki były podawane jako wartości średnie (M) ± odchylenie standardowe (SD) i były analizowane przy użyciu nieparametrycznej analizy wariancji (test Fredmana) a następnie testem Wilcoxona. Wartość p <0,05 była przyjęta jako statystycznie znamienna. Zanotowano statystycznie znamienny wzrost utleniania lipidów w czasie T1, T2, T3 i T4 w stosunku do czasu T0.
Produkty utleniania lipidów zostały zidentyfikowane jako etan, pentan, heksan i ich pochodne. Nie było korelacji pomiędzy stopniem utleniania lipidów a wiekiem pacjentów, czasem trwania operacji, czasem CPB i czasem zakleszczenia aorty. Głównym budulcem błon komórkowych są lipidy, ich utlenianie może więc prowadzić do zniszczenia komórek a nawet ich śmierci. Pomiary poziomu etanu i pentanu są powszechnie stosowaną metodą detekcji utleniania lipidów w różnych stanach chorobowych (np. astma, zawał serca). Wyniki pracy wykazały, iż utlenianie lipidów ma także miejsce podczas operacji z użyciem krążenia pozaustrojowego; brak korelacji pomiędzy stopniem utlenienia a czasem ECC i Ao-Cx może wskazywać, iż utlenianie lipidów jest tylko jednym z wielu mechanizmów związanych z patogenezą pokrążeniowego SIRS.
Summary
Cardiopulmonary bypass (CPB) is often associated with systemic inflammatory response (SIRS) that leads to organ dysfunction. Several mechanisms causing post-EEC SIRS have been described, some of them not being fully understood. The aim of the study was to assess degree of lipid peroxidation (LO) during EEC for coronary artery bypass grafting (CABG). After approval of the local Ethic Committee and obtaining informed consent, twenty patients, aged 39-74 yrs, scheduled for elective CABG, were enrolled to the study. Anaesthesia, surgery and ECC protocols were uniform. 10 cc blood samples were taken after induction of anaesthesia (T0), 10 min after the start of ECC (T1), 10 min after aorting cross clamping (T2), 10 min (T3) and 1 h after termination of ECC (T4). Time of surgery, ECC and aortic cross clamp (Ao-cx) were recorded. LO was measured as peak area (PA) by head-space gas chromatography. A mass spectrometer was used for qualitative analysis of obtained peaks. Data were reported as mean values (M) ± SD and were analyzed by non-parameter analysis of variance (Friedman test) followed by Wilcoxon test. P value of 0.05 was considered significant. There was a statistically significant increase of LO at T1, T2, T3 and T4 when compared to T0. LO products were identified as pentane, hexane and derivatives. There was no correlation between degree of oxidation (peak area) and time of procedure, ECC, Ao-cx or age. Since the lipid is the major constituent of lipid membrane, its peroxidation can lead to the cell damage and death. Pentane measurement is widely accepted method of detection of LO in various clinical situations. This study shows that lipid peroxidation occurs during ECC; however, the lack of correlation between LO and ECC and/or Ao-cx time indicate that oxidative damage may be regarded as a solely mechanism involved in pathogenesis of post pump syndrome.
Przeprowadzenie wielu skomplikowanych zabiegów kardiochirurgicznych stało się możliwe dzięki wprowadzeniu krążenia pozaustrojowego (ECC), które nierozerwalnie łączy się z wyłączeniem z funkcjonowania (i ukrwienia) serca i płuc (bypass sercowo-płucny – CPB) w kluczowym momencie operacji. Pomimo ogromnego postępu technicznego i poprawy biokompatybilności elementów aparatu do krążenia pozaustrojowego ECC jest związane z występowaniem wielu powikłań pooperacyjnych [1]. Spośród narządów najczęściej nimi dotkniętych należy wymienić płuca, nerki, ośrodkowy układ nerwowy oraz jelita [2]. Od czasu wprowadzenia CPB do praktyki kardiochirurgicznej powstały liczne prace poświęcone patogenezie zaburzeń ogólnoustrojowych wywołanych tą metodą. Odkryto, iż powstawanie systemowej reakcji zapalnej (SIRS) jaka ma miejsce po użyciu CPB jest schorzeniem wieloczynnikowym [3,4]. Spośród najważniejszych przyczyn należy wymienić aktywacje układu dopełniacza, aktywacje granulocytów obojętnochłonnych, mechanizmy niedokrwienie/reperfuzja, uwalnianie cytokin prozapalnych oraz wolnych rodników i aktywnych form tlenowych. Wspomniane rodniki i aktywne postaci tlenu cechują się bardzo wysoką aktywnością chemiczną i w związku z tym znacznym potencjałem uszkadzającym [5]. Szczególnie silnie reagują z lipidami, które są głównym składnikiem błon komórkowych [6].
Celem obecnej pracy jest próba oceny utleniania lipidów podczas zabiegów pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG) z użyciem CPB przy pomocy metody chromatografii gazowej fazy nadpowierzchniowej.
METODYKA
Pacjenci i pobieranie próbek do badań. Projekt i metody badania uzyskały zgodę Komisji Bioetycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego. Badaniem objęto 20 chorych w wieku 39-74 lat poddanych w trybie planowym CABG. Wszyscy pacjenci biorący udział w badaniu podpisywali formularz świadomej zgody. Podczas zabiegu pięciokrotnie pobierano próbki krwi w ilości 8 ml (z cewnika umieszczonego w żyle centralnej): w czasie T0 (po wprowadzeniu do znieczulenia ogólnego), w czasie T1 (10 min. po rozpoczęciu CPB), w czasie T2 (10 min. po odkleszczeniu aorty ), w czasie T3 (10 min. po zakończeniu CPB) i w czasie T4 (1 h po zakończeniu CPB). Ponadto mierzono czasy trwania operacji, CPB oraz zakleszczenia aorty. Powyższe dane przedstawiono w tabeli I.
Tab. I. Parametry ogólne
| Cecha | Minimum | Kwartyl | Mediana | Kwartyl | Maksimum | Średnia | SD | Normalność (p) |
| Wiek | 39 | 52,0 | 59,5 | 63,0 | 74 | 57,9 | 8,6 | 0,729 |
| Czas krążenia | 41 | 70,0 | 82,5 | 105,0 | 155 | 87,8 | 27,0 | 0,401 |
| Czas zakleszczenia | 22 | 32,0 | 37,5 | 44,5 | 88 | 40,6 | 16,1 | 0,005 |
Metody znieczulenia i krążenia pozaustrojowego. Metoda znieczulenia była identyczna we wszystkich 20 przypadkach. Do indukcji znieczulenia użyto 0,2 mg kg-1 etomidatu (Hypnomidate, Jansen, Belgia), 0,2 mg fentanylu (Polfa-Warszawa) i bromku pankuronium (Jelfa). Znieczulenie podtrzymywano przy pomocy wlewu 20 mcg kg -1 h -1 fentanylu i 0,4 mg kg -1 h -1 midazolamu (Dormicum, Roche, Francja) oraz frakcjonowanych dawek pankuronium. Przed rozpoczęciem CPB podawano heparynę w dawce 300 U kg -1 w celu wydłużenia ACT ponad 480 s. Po zakończeniu CPB działanie heparyny odwracano przy użyciu siarczanu protaminy w stosunku 1: 1,5. Przed rozpoczęciem CPB i po jego zakończeniu płuca wentylowano mieszaniną tlenu i powietrza w stosunku 1: 1. Podczas trwania CPB płuc nie wentylowano.
Metody krążenia pozaustrojowego także były podobne we wszystkich 20 przypadkach. Aparat do krążenia pozaustrojowego (Jostra, USA) wyposażony był w oksygenator membranowy typu hollow fiber (Monolyth, Sorin Biomedica, USA), priming składał się z 1000 ml mleczanu Ringera (Polfa Kutno), 500 ml 10% roztworu hydroksyetylowanej skrobi (Polfa Kutno) oraz 100 ml mannitolu (Baxter, USA) i 10000 U heparyny. W celu wykonywania zespoleń dystalnych zakleszczano aortę i zatrzymywano serce przy użyciu krystalicznej kardiopleginy wg formuły St. Thomas w temperaturze 28oC.
Metody analizy ilościowej i jakościowej utleniania lipidów. Po odwirowaniu próbek krwi osocze składowano w temperaturze – 70° C w specjalnych 10 ml fiolkach zaopatrzonych w teflonowy korek (Alltech Technology, USA). Pomiary zawartości produktów utleniania lipidów wykonywano przy użyciu metody chromatografii gazowej fazy nadpowierzchniowej – aparat Hewlett Packard (HP 6890, Waldbrom, Niemcy) zintegrowany z kolumną do pomiaru lekkich związków organicznych (Restec, Belleforte, USA). Gazem nośnym był hel, a prędkość jego przepływu wynosiła 1,5 ml min -1. Faza nadpowierzchniowa była pobierana do analizy automatycznie przez chromatograf i była podgrzewana do 60oC w przeciągu 2 min. a następnie do 200oC w przeciągu 5 min. Substancje wykryte przez chromatogaf przedstawione były jako piki o kreślonym czasie retencji. W celu dokonania analizy ilościowej uzyskanych związków mierzono pole powierzchni zawarte pod danym pikiem. W celu analizy jakościowej uzyskanych pików (substancji) posłużono się metodą spektrometrii masowej wykorzystując aparat firmy Finnigan (Finnigan-Polaris Q, Austin, USA). W celu dodatkowej identyfikacji uzyskanych związków porównano ich czasy retencji z czasami retencji standardów wewnętrznych komercyjnie dostępnych i zawieszonych w 5% albuminie ludzkiej (Pentan i Heksan, Sigma, USA).
Statystyka. Dla parametrów wyrażonych w skali przedziałowej (ciągłych) podano minimum i maksimum (to znaczy element najmniejszy i największy), obliczano dolny i górny kwartyl, medianę, średnią, odchylenie standardowe. Sprawdzono normalność rozkładów testem Shapiro-Wilka opartym na analizie wariancji. Rozkłady większości parametrów różniły się od rozkładu normalnego przy przyjętym poziomie istotności ?=0,05.
Pomiary dla badanych parametrów dla każdego pacjenta były przeprowadzane pięciokrotnie w różnych ale ustalonych okresach czasowych. W celu wykonania porównań między poszczególnymi pomiarami zastosowano nieparametryczną analizę wariancji – test Friedmana dla prób zależnych (parametrycznej analizy wariancji nie można było zastosować ze względu na niespełnienia założeń; między innymi nie było spełnione założenie o normalności rozkładów). Jeśli nieparametryczna analiza wariancji wykazała istnienie różnic statystycznie istotnych, to w celu ustalenia między jakimi okresami czasowymi są różnice zastosowano test nieparametryczny Wilcoxona dla każdych dwóch okresów czasowych.
Zależności między cechami opisano za pomocą współczynnika korelacji liniowej Pearsona dla parametrów o rozkładach normalnych, a dla parametrów nie spełniających założenia o normalności rozkładów obliczono współczynnik korelacji Spearmana i sprawdzono istotność obliczonych współczynników korelacji.
WYNIKI
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Hsu L-C: Biocompatibility in cardiopulmonary bypass. J Cardiothorac Vasc Anesth 1997; 11: 376-382.
2. Wąsowicz M, Sobczyński P, Biczysko W, Szulc R: Ultrastructural changes in the lung alveoli after cardiac surgical operations with the use of cardiopulmonary bypass (CPB). Pol J Pathol 1999; 50: 189-196.
3. Cremer J, Martin M, Redl H, Bahrami S, Abraham C, Greater T: Systemic inflammatory response after cardiac operations. Ann Thorac Surg 1996; 61: 1714-1720.
4. Picone A, Lutz CJ, Finck C, Carney D, Gatto LA, Paskanik A, Searles B, Snyder K, Nieman G: Multiple sequential insults cause post-pump syndrome. Ann Thorac Surg 1999; 67: 978-985.
5. Royston D, Flemming JS, Desai JB, Westaby S, Taylor K: Increased production of peroxidation products associated with cardiac operations. Evidence for free radical generation. J Thorac Cardiovasc Surg 1986; 91: 759-766.
6. Messent M, Sinclair DG, Quinlan G, Mumby SE, Gutteridge JMC, Evans T: Pulmonary vascular permeability after cardiopulmonary bypass and its relationship to oxidative stress. Crit Care Med 1997; 25: 425-429.
7. Mendis S, Sobotka PA, Leja FL, Euler DE: Breath pentane and plasma lipid peroxides in ischaemic heart disease. Free Radic Biol Med 1995; 19: 679-684.
8. Schubert JK, Müller WPE, Benzing A, Geiger K: Application of a new method for analysis of exhaled gas in critically ill patient. Inten Care Med 1998; 24: 415-421.
9. Weitz ZE, Birnbaum AJ, Sobotka PA, Zarling EJ, Soskey JL: High breath pentane concentration during acute myocardial infarction. Lancet 1991, 337, 933-935.
10. Morita S, Snider MT, Inada Y: Increased n-pentane excretion in humans: a consequence of pulmonary oxygen exposure. Anesthesiology 1986, 64, 730-733.
11. Sprinfield JR, Levitt MD: Pitfalls in the use of breath pentane measurements to assess lipid peroxidation. J Lipid Res 1994; 35: 1497-1504.
12. Mendis S, Sobotka PA, Euler DE: Pentane and isoprene in expired air from humans: a gas chromatographic analysis of single breath. Clin Chem 1994; 40: 1485-1488.
13. Knutson MD, Handelman GJ, Viteri FE: Methods for measuring ethane and pentane in expired air from rats and humans. Free Rad Biol Med 2000; 28: 514-519.
14. Pepper JR, Mumby S, Gutterdge JMC: Blood cardioplegia increases plasma iron overload and thiol levels during cardiopulmonary bypass. Ann Thorac Surg 1995; 60: 1735-1740.
15. Wilson WC, Laborge PR, Benumof JL, Taylor R, Swetland JF: Reperfusion injury and exhaled hydrogen peroxide. Anesth Analg 1993; 77: 963-970.
16. Nathan N, Denizot Y, Cornu E, Jauberteau O, Chauvreau C, Feiss P: Cytokine and lipid mediator blood concentration after coronary artery surgery. Anesth Analg 1997; 85: 1240-1246.
