Ekstrakty, frakcje i wyizolowane substancje biologicznie aktywne z glistnika jaskółczego ziela (Chelidonium majus L.) odznaczają się działaniem przeciwbakteryjnym, przeciwgrzybiczym, przeciwwirusowym, przeciwpierwotniakowym i przeciwpasożytniczym. Przegląd przeciwdrobnoustrojowego działania tej rośliny opisano we wcześniejszej pracy (1).

Skład chemiczny omawianej rośliny, w tym występowanie w niej alkaloidów, flawonoidów i białek także szczegółowo udokumentowano we wcześniejszym opracowaniu (2).

Założeniem prezentowanej pracy było uzyskanie surowca o wysokiej zawartości związków biologicznie aktywnych, a co za tym idzie o wysokiej aktywności antybiotycznej. W tym celu do badań wykorzystano uprawę gruntową glistnika oraz hodowlę siewek w warunkach in vivo.

Badaniami objęto ekstrakty etanolowe i wodne z ziela i siewek glistnika oraz frakcje białkowe i niebiałkowe otrzymane z ekstraktów wodnych wymienionych surowców. Analizowano je pod względem aktywności antybiotycznej oraz występujących w nich związków alkaloidowych i flawonoidowych.

Założono także działanie najbardziej aktywnego antybiotycznie ekstraktu etanolowego uzyskanego z ziela glistnika na bakterie chorobotwórcze występujące w środowisku szpitalnym.

Wartość biologiczną ziela glistnika określano w ramach upraw gruntowych polskiej tetraploidalnej odmiany Cynober. Uprawę glistnika założono w 2010 r. metodą wysiewu nasion do gruntu w terminie jesiennym na poletkach o powierzchni 12 m².

Do badań ziele glistnika zbierano w dwóch sezonach wegetatywnych (2011 i 2012 r.) w 6 fazach fenologicznych: rozety liściowej wiosennej, początku kwitnienia roślin, pełni kwitnienia roślin, zielonego owocu (strąka), pełnej dojrzałości nasion i rozety liściowej jesiennej. Surowiec po zbiorze suszono w temp. 60°C.

Hodowlę siewek in vivo prowadzono przy użyciu nasion otrzymanych z uprawy gruntowej (zbioru dokonano w 2010 r.) tej samej odmiany glistnika (Cynober). Na tę formę surowca zdecydowano się po uprzednich niepowodzeniach z uzyskaniem ziela z kalusa i nasion hodowanych na pożywkach sztucznych.

Nasiona glistnika wysiewano do doniczek z jałową glebą i elicytowano je frakcjonowanym wyciągiem drożdżowym. Rośliny zbierano po 7 dniach wegetacji i suszono w temp. pokojowej.

Do sporządzania ekstraktów etanolowych używano wysuszonego i rozdrobnionego ziela (sito 5,6 mm). Surowiec ekstrahowano 50% etanolem w stosunku 1:10. Po oddestylowaniu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem w temp. 50°C i wymrożeniu do -50°C ekstrakty poddawano liofilizacji.

Ekstrakty wodne otrzymywano z wysuszonego i rozdrobnionego surowca (sito 0,315 mm), który poddawano działaniu wody oczyszczonej przez 3 godz. w temp. 90°C w stosunku 1:10. Po ochłodzeniu ekstrakty sączono przez watę i gazę, oddestylowywano połowę rozpuszczalnika, wymrażano do -50°C i poddawano liofilizacji.

W celu przygotowania frakcji białkowych i niebiałkowych wysuszony i rozdrobniony surowiec (sito 1,0 mm) umieszczano w komorze ekstraktora i zalewano wodą destylowaną w stosunku 1:10. Ekstrakcję prowadzono w temp. 90°C przez 3 godziny. Po ochłodzeniu i przesączeniu przez sito stalowe i filtr bawełniany, połowę rozpuszczalnika oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem w temp. 50°C. Z zagęszczonego ekstraktu białka wytrącano acetonem w stosunku 1:4 w temp. -20°C przez 30 minut. Frakcję białkową odwirowywano (4500 obr./min) w temp. 4°C przez 20 min i po zawieszeniu w wodzie destylowanej liofilizowano (wydajność ok. 78%). Supernatant (frakcja niebiałkowa) zagęszczono dziesięciokrotnie w wyparce próżniowej i liofilizowano w warunkach podanych powyżej.

W ekstraktach etanolowych i wodnych otrzymanych z ziela i siewek glistnika oraz we frakcjach białkowych i niebiałkowych uzyskanych z ekstraktów wodnych tych surowców oznaczano ogólną zawartość alkaloidów (w przeliczeniu na chelidoninę) oraz ogólną zawartość flawonoidów (w przeliczeniu na kwercetynę). Oznaczenia prowadzono w oparciu o monografię surowca (Chelidonii herba) zawartą w Farmakopei Europejskiej 6 (3).

Oznaczenia ilościowe alkaloidów typu benzofenantrydyny (chelidonina, chelerytryna, sangwinaryna) oraz typu protoberberyny (koptyzyna, berberyna) prowadzono metodą HPLC DAD przy użyciu urządzenia Agilent 1100, natomiast oznaczenia ilościowe flawonoidów – metodą spektrofotometryczną.

Badane ekstrakty i frakcje w ilości 100 mg rozpuszczano w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Z uzyskanych roztworów podstawowych (o stężeniu 100 mg/ml) przygotowywano następnie w podłożu bakteriologicznym Antibiotic Broth (Merck) rząd rozcieńczeń w zakresie stężeń 0,5-15 mg/ml. Do każdego rozcieńczenia ekstraktu lub frakcji o objętości 1 ml dodawano po 0,1 ml 18-godz. hodowli płynnej szczepu wzorcowego Staphylococcus aureus ATCC 6538P, rozcieńczonej 1:10 000 w tym samym podłożu (liczba dodawanych komórek wynosiła ok. 10³ w 0,1 ml). Inkubację próbek prowadzono w temp. 37°C przez okres 24 godzin. Po tym czasie ze wszystkich rozcieńczeń ekstraktu lub frakcji wykonywano posiewy na stałe podłoże Antibiotic Agar. Po dalszych 24 godzinach określano rozcieńczenia próbki, które całkowicie hamowały rozwój szczepu wzorcowego. Rozcieńczenia te odpowiadały najmniejszemu stężeniu bakteriobójczemu ekstraktu lub frakcji (ang. Minimal Bactericidal Concentration – MBC). Wartości te przeliczano z kolei na jednostki antybiotyczne (JA), przyjmując, że są one równe 1 JA. Wyniki podawano w odniesieniu do 1 g badanego ekstraktu lub frakcji. Dla przykładu MBC określone dla szczepu wzorcowego jako 1,0 mg/ml wskazuje, że 1 g ekstraktu lub frakcji odznacza się aktywnością antybiotyczną równą 1000 JA.