© Borgis - Postępy Fitoterapii 2/2015, s. 83-88
*Elżbieta Anuszewska, Janina Drozd, Ewa Drozd, Beata Gruber
Aktywność immunostymulująca frakcji polisacharydowych uzyskanych z produktu leczniczego Biostymina® (Aloe arborescens folii recentis extractum fluidum)
Immunomodulatory activity of two polysaccharide fractions isolated from Biostymina® (Aloe arborescens folii recentis extractum fluidum)
Zakład Biochemii i Biofarmaceutyków, Narodowy Instytut Leków w Warszawie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. farm. Elżbieta Anuszewska
Summary
Aloe arborescens Mill. is one of the most wide-ranging species in the genus Aloe L. and has been reported to have several medicinal uses, including anti-bacterial, anti-viral, anti-fungal and anti-inflammatory activity.
Fresh leaves of Aloe arborescens contain various groups of chemical compounds which show multidirectional therapeutic action: glycoproteins, polysaccharides, anthraquinones, amino acids, vitamins and minerals. Polysaccharide substances are characterized as the modulating the human immune system by stimulating the production of macrophages and improving the activity of T-lymphocytes. Therapeutic qualities of fresh leaves are used in Poland by Phytopharm Klęka S.A. in the manufacture of medicinal product – Biostymina® (Aloe arborescens folii recentis extractum fluidum).
The present work was undertaken to evaluate the immunomodulatory activity of two polysaccharide fractions isolated from Biostymina® which differ in molecular weight. The influence of polysaccharide fraction on the mouse immune system were estimated by testing of the survival rate of mouse thymocytes cultured with hydrocortisone in cytotoxicity test and the increase of the ability of splenocytes to attach to sheep erythrocytes in E-rosette test.
The obtained results show that polysaccharide fractions increase the survival rate of mouse thymocytes and the count of splenocytes forming spontaneous rosettes. Comparison of the results for polysaccharide fractions with those obtained for Biostymina® shows the differences between the immunomodulatory activity of both. Biostymina® exerts the higher stimulatory effect on mouse immune system than polysaccharide fractions.
Wstęp
Spośród przeszło 300 gatunków aloesu, z których tylko 20 uważa się za lecznicze, powszechne zastosowanie znalazły dwa: aloes zwyczajny (Aloe barbadensis Mill., znany także pod nazwą Aloe vera L.) i aloes drzewiasty (Aloe arborescens Mill.).
Aloes drzewiasty jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych gatunków z rodzaju Aloe L., a z uwagi na szerokie zastosowanie w przemyśle żywnościowym, kosmetycznym i farmaceutycznym, poza stanem naturalnym, uprawiany jest także na plantacjach, głównie w Chinach, Japonii, obu Amerykach, a także w Polsce (1) (ryc. 1).
Ryc. 1. Kwitnący aloes drzewiasty (Aloe arborescens Mill.).
Preparaty uzyskiwane z tej rośliny od dziesiątków lat stosowane są w profilaktyce i terapii ludzi i zwierząt, w wielu chorobach, takich jak zakażenia bakteryjne, wirusowe i grzybicze, rany i owrzodzenia oraz choroby układu pokarmowego (2). Właściwości przeciwutleniające i stymulujące układ odpornościowy wykorzystywane są także w zapobieganiu chorobom cywilizacyjnym i ich terapii (3-6).
W procesie wytwarzania różnych produktów stosuje się sok, miąższ lub świeże liście aloesu. Skład substancji aktywnych w gotowym produkcie jest zmienny, w zależności od gatunku, wieku rośliny, warunków uprawy i klimatu, a także od sposobu przygotowania, czyli rodzaju ekstrahenta i warunków przeprowadzenia ekstrakcji (7-10). Jednakże wszystkie produkty w mniejszej lub większej ilości zawierają (2, 11):
– glikozydy antranoidowe,
– cukry proste i złożone – polisacharydy,
– glikoproteiny,
– sole licznych pierwiastków,
– witaminy,
– aminokwasy i enzymy.
Produkty pochodzenia naturalnego, a zwłaszcza pochodzenia roślinnego, cechuje złożony skład chemiczny i zazwyczaj cały zespół substancji znajdujących się w surowcu decyduje o jego działaniu biologicznym. Jednakże szereg badaczy podejmuje próby izolacji substancji czynnych z surowców roślinnych, mając nadzieję na uzyskanie produktu o lepszym indeksie terapeutycznym. Uważa się, że za aktywność biologiczną preparatów aloesowych odpowiedzialne są głównie substancje o budowie wielocukrów i glikoprotein, i te dwie grupy związków najbardziej interesują badaczy (11-13).
Hodowlę aloesu drzewiastego na terenie Polski prowadzi na skalę przemysłową Phytopharm Klęka S.A., w Klęce pod Poznaniem. Uprawy szklarniowe zapobiegają bardzo łatwemu krzyżowaniu aloesu drzewiastego z innymi gatunkami, przez co rośliny tam hodowane zachowują stabilny skład substancji czynnych. Z liści trzyletniego aloesu drzewiastego produkowany jest wodny wyciąg, który pod nazwą handlową Biostymina® stosowany jest w lecznictwie od kilkudziesięciu lat. Wytwórca Biostyminy® podjął próbę identyfikacji związków odpowiedzialnych za działanie wyciągu stymulujące układ immunologiczny.
Podjęte badania miały na celu ocenę aktywności immunostymulującej dwóch wyizolowanych frakcji polisacharydowych różniących się masą cząsteczkową i porównanie ich z produktem macierzystym – Biostyminą®, i syntetycznym immunostymulatorem – izoprynozyną.
Materiały i metody
Zwierzęta
W badaniach użyto myszy szczepu wsobnego Balb/c, samic w wieku 4 tyg., o masie ciała ok. 16 g (test cytotoksyczności), oraz w wieku 6-8 tyg., o masie ciała ok. 20 g (test hemaglutynacji i test tworzenia rozet). Zwierzęta pozyskiwano z hodowli Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny.
Doświadczenia z udziałem zwierząt wykonano za zgodą IV Lokalnej Komisji Etycznej (zezwolenie nr 47/2013; 06/NIL/2010).
Płyny hodowlane
Stosowano następujące płyny hodowlane:
– podłoże RPMI-1640, z glutaminą i NaHCO3 (Sigma),
– zbuforowany roztwór soli fizjologicznej PBS (IITD Wrocław),
– płyn Hanksa (z 0,5% dodatkiem hydrolizatu laktoalbuminy) (IITD Wrocław).
Odczynniki
Używano następujące odczynniki chemiczne:
– hydrokortyzon (Corhydron), 25 mg, proszek i rozpuszczalnik (Jelfa S.A.),
– krwinki czerwone owcy (SRBC), stabilizowane w płynie Alsewera (GRASO Biotech),
– płyn Alsewera (glukoza, cytrynian sodu, chlorek sodu, kwas cytrynowy) (POCH),
– izofluran (Aerrane), płyn (Baxter),
– surowica cielęca płodowa (Bioprodukt),
– błękit trypanu substancja i fiolet krystaliczny substancja (Merck),
– Gradisol L 1,077 g/ml (Aqua Medica).
Immunostymulatory
W badaniach wykorzystano wymienione poniżej immunostymulatory:
– Biostymina®, płyn doustny (Phytopharm Klęka S.A.),
– frakcja I (FI) – polisacharyd o masie 8 kDa (Phytopharm Klęka S.A.),
– frakcja II (FII) – polisacharyd o masie 0,8 kDa (Phytopharm Klęka S.A.),
– izoprynozyna substancja (AKSci).
Biostyminę® w teście cytotoksyczności stosowano w dawkach 2, 4, 6 i 8 μl/ml hodowli oraz w teście hemaglutynacji i tworzenia rozet w dawkach 2, 4, 6 i 8 μl/mysz – podanie doustne (14, 15).
Izoprynozynę po rozpuszczeniu w PBS stosowano w dawkach: 0,1, 1,0, 1,5 i 2,0 mg/ml hodowli/mysz (podanie doustne) (15).
Frakcje FI i FII po rozpuszczeniu w PBS stosowano w ilościach odpowiadających ich zawartości w Biostyminie®. Zgodnie z deklaracją wytwórcy 1,0 ml Biostyminy® zawiera 1,7 mg FI i 0,83 mg FII (tab. 1).
Tabela 1. Dawki immunostymulatorów stosowane w badaniach na zwierzętach.
Biostymina®
(μl/1 ml hodowli) | Frakcja FI
(μg/μl) | Frakcja FII
(μg/μl) |
| 2 | 3,4/2 | 1,67/2 |
| 4 | 6,9/4 | 3,34/4 |
| 6 | 10,2/6 | 5,01/6 |
| 8 | 13,8/8 | 6,68/8 |
Test cytotoksyczności
Test wykonano w warunkach jałowych. Czterotygodniowe myszy usypiano izofluranem, pobierano grasice, a następnie przecierano je przez metalowe sito (średnica oczek ok. 300 μm). Tymocyty otrzymane z rozdrobnionych grasic przepłukiwano trzykrotnie RPMI-1640 i wirowano (1800 obr./min przez 7-8 min). Po ostatnim wirowaniu tymocyty w liczbie 4 x 106 komórek w 1 ml zawieszano w RPMI-1640 z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej. Zawiesinę tymocytów rozlewano po 1 ml do jałowych probówek i dodawano odpowiednie ilości: Biostyminy®, frakcji FI i FII lub izoprynozyny. Po upływie 1 godz. do hodowli tymocytów dodawano hydrokortyzon w stężeniu 50 μg/ml. Tak przygotowane próby inkubowano przez 18-20 godz. w temperaturze 37oC i w atmosferze 5% CO2. Po tym czasie w każdej hodowli zliczano po zabarwieniu 0,04% roztworem błękitu trypanu 100 komórek, osobno liczbę żywych i martwych.
W hodowlach kontrolnych bez hydrokortyzonu liczba żywych komórek powinna wynosić powyżej 80% pierwotnej liczby komórek (tab. 2). Względna przeżywalność komórek (stosunek procentu komórek żywych w hodowlach z hydrokortyzonem do procentu żywych komórek w hodowli kontrolnej) powinna mieścić się w granicach 50-65%. Względna przeżywalność komórek poniżej 50% lub powyżej 65% dyskwalifikuje doświadczenie (tab. 2).
Tabela 2. Odsetek żywych tymocytów w hodowlach kontrolnych.
| Kontrola | Kontrola + HC | Względna przeżywalność
tymocytów |
89,0 ± 1,81
n = 16 | 50,7 ± 1,82
n = 16 | 57,0 ± 2,04
n = 16 |
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Anuszewska E. Aloes drzewiasty (Aloe arborescens Miller) – ponadczasowa roślina lecznicza. Czas Apt 2014; 21(244):43-51. 2. Bastian P, Fal AM, Jambor J i wsp. Candelabra Aloe (Aloe arborescens) in the therapy and prophylaxis of upper respiratory tract infections: traditional use and recent research results. Wien Med Wochenschr 2013; 163(3-4):73-9. 3. Basta P, Pilaczyńska-Szczęsniak Ł, Woitas-Ślubowska D i wsp. Influence of Aloe arborescens Mill. extract on selected parameters of pro-oxidant-antioxidant equilibrium and cytokine synthesis in rowers. Int J Sport Nutr Metab 2013; 23(4):388-98. 4. Beppu H, Shimpo K, Chihara T i wsp. Antidiabetic effects of dietary administration of Aloe arborescens Miller components on multiple low-dose streptozocin-induced diabetes in mice investigation on hypoglycemic action and systemic absorption dynamics aloe components. J Ethnopharmacol 2006; 103(3):468-77. 5. Furukawa F, Nishikawa A, Chihara T i wsp. Chemopreventive effects of Aloe arborescens on N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine-induced pancreatic carcinogenesis in hamsters. Cancer Lett 2002; 178(2):117-22. 6. Lissoni P, Rovelli F, Brivio F i wsp. A randomized study of chemotherapy versus biochemotherapy with chemotherapy plus Aloe arborescens in patients with metastatic cancer. In Vivo 2009; 23(1):171-5. 7. Gutterman Y, Chauser-Volfson E. The distribution of the phenolic metabolites barbaloin, aloeresin and aloenin as a peripheral defense strategy in the succulent leaf parts of Aloe arborescens. Biochem Syst Ecol 2000; 28(9):825-38. 8. Coopoosamy RM, Naidoo KK. A comparative study of three Aloe species used to treat skin diseases in South African rural communities. J Altern Complement Med 2013; 19(5):425-8. 9. Shimpo K, Ida C, Chihara T i wsp. Aloe arborescens extract inhibits TPA-induced ear oedema, putrescine increase and tumour promotion in mouse skin. Phytother Res 2002; 16(5):491-3. 10. Gutterman Y, Chauser-Volfson E. The content of secondary phenol metabolites in pruned leaves of Aloe arborescens, a comparison between two methods: leaf excrudants and leaf water extract. J Nat Med 2008; 62(4):430-5. 11. Roge A, Kość A, Warwas M. Przydatność w leczeniu i mechanizmy działania aloesu – współczesne poglądy. Farm Pol 2000; 56(8):381-5. 12. Jia Y, Zhao G, Jia J. Preliminary evaluation: The effects of Aloe ferox Miller and Aloe arborescens Miller on wound healing. J Ethnopharmacol 2008; 120(2):181-9. 13. Yagi A, Nishimura H, Shid T i wsp. Structure determination of polysaccharides in Aloe arborescens var. natalensis. Planta Med 1986; 52(3):213-8. 14. Białas-Chromiec B, Skopińska-Różewska E, Strzelecka H i wsp. Immunomodulujące właściwości Biostyminy – wodnego wyciągu z liści roślin trzyletnich Aloe arborescens Mill. Onkol Pol 2000; 3(2):85-9. 15. Drozd J, Anuszewska E. Działanie immunostymulujące wodnego wyciągu z liści aloesu drzewiastego (Aloe arborescens Mill.). Post Fitoter 2014; 1:16-20. 16. Adler FL. Studies on mouse antibodies. I. The response to sheep red cells. J Immunol 1965; 95:26-38. 17. Sawicka T, Prosińska J, Drozd J. Wpływ wybranych kwasów porostowych na odpowiedź komórkową i humoralną układu immunologicznego myszy. Biul Inst Lek 1997; 41(1):17-24. 18. Trainin N, Levo Y, Rotter V. Resistance to hydrocortisone conferred upon thymocytes by a thymic humoral factor. J Immunol 1974; 4:634-7. 19. Ahmed SA, Sriranga N. Differential effects of dexamethasone on the thymus and spleen: alteration programmed cell death, lymphocyte subsets and activation of T cells. Immunopharmacol 1994; 28:55-66. 20. Kucharska E. Wpływ Biostyminy na niektóre procesy immunologiczne. Ann Acad Med Stetin 1996; 26:369-86. 21. Bach JG, Dardenne M. Antigen recognition by T lymphocytes. Cell Immunol 1972; 3(1):1-21. 22. Glatthaar-Saalmüller B, Michalak A, Bastian P i wsp. Ocena aktywności przeciwwirusowej in vitro preparatów Biostymina i Bioaron C względem ludzkiego rinowirusa (HRV14). Post Fitoter 2012; 3:156-61. 23. Schönknecht K, Conrad F, Sievers H i wsp. Anti-viral activity of Biostymina (Aloe arborescens folii recentis extractum fluidum) against viruses causing upper respiratory tract infection tested in vitro. Post Fitoter 2014; 3:127-35. 24. Leung MY, Liu C, Koon JC i wsp. Polysaccharide biological response modifiers. Immunol Lett 2006; 105(2):101-14. 25. Yagi A, Makino K, Nishioka I i wsp. Aloe mannan, a polysaccharide from Aloe arborescens var. natalensis. Planta Med 1977; 31:17-20. 26. Qiu Z, Jones K, Wylie M i wsp. Modified Aloe barbadensis polysaccharide with immunoregulatory activity. Planta Med 2000; 66(2):152-6. 27. Im SA, Oh ST, Song S i wsp. Identification of optimal molecular size of modified Aloe polysaccharides with maximum immunomodulatory activity. Int Immunopharmacol 2005; 5(2):271-9.
