Reaktywne formy tlenu (RFT) to cząsteczki chemiczne stale obecne w niewielkim stężeniu w prawidłowych komórkach – są wytwarzane i zużywane w wyniku procesów metabolicznych. Zaliczamy do nich wolne rodniki, czyli atomy lub cząsteczki zawierające niesparowane elektrony, do których należą między innymi anionorodnik ponadtlenkowy O₂^·-, rodnik wodoronadtlenkowy HO₂^·-, rodnik peroksylowy ROO^·, rodnik hydroksylowy OH^· oraz RFT niebędące wolnymi rodnikami, między innymi tlen O₂, ozon O₃ i nadtlenek wodoru H₂O₂ (1, 2). RFT spełniają w komórkach rolę cząsteczek sygnałowych. Przede wszystkim uruchamiają odpowiedź zapalną poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych i indukcję wytwarzania cytokin (3). Wykazano również, że brak RFT ma konsekwencje w postaci osłabienia funkcji komórek fagocytujących i zmniejszonego usuwania bakterii i grzybów (3). Poza rolą w uruchamianiu odpowiedzi zapalnej i fagocytozy, RFT biorą udział jako przekaźniki informacji w procesach starzenia komórek i naprawy tkanek (1).

Zachowanie równowagi pomiędzy wytwarzaniem i usuwaniem RFT jest konieczne do utrzymania prawidłowego stanu redoks. W tym celu komórki są wyposażone w enzymatyczne i nieenzymatyczne mechanizmy antyoksydacyjne (przeciwutleniające). Do antyoksydantów nieenzymatycznych należą między innymi witaminy A, C i E, ubichinon, melatonina, kwas moczowy, transferyna, haptoglobina i przede wszystkim glutation (1). Glutation występuje w postaci zredukowanej (GSH) lub utlenionej (GSSG) i dzięki możliwości odwracalnego utleniania grup tiolowych bierze udział w reakcjach redoks jako związek redukujący. Ponadto działa jako kofaktor wielu enzymów antyoksydacyjnych (1, 4).

Najważniejsze enzymy biorące udział w obronie komórki przed skutkami nadmiernej produkcji RFT to: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT), peroksydaza glutationowa (GPx) i peroksyredoksyna (Prx). SOD katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego, w wyniku której powstaje H₂O₂. Nadtlenek wodoru jest słabym oksydantem, ale w obecności jonów metalu, np. żelaza, jest przekształcany w bardzo reaktywny rodnik hydroksylowy (2). H₂O₂ jest dalej rozkładany przez jeden z pozostałych enzymów (CAT, GPx lub Prx) (3). Katalaza rozkłada wyłącznie H₂O₂, peroksydaza glutationowa dodatkowo nadtlenek organiczny, a peroksyredoksyna ma najszersze spektrum działania i usuwa pięć różnych związków utleniających, w tym H₂O₂ (5). Inne enzymy zaangażowane w obronę antyoksydacyjną to między innymi reduktaza glutationowa, odtwarzająca pulę zredukowanego glutationu, oraz proteazy i hydrolazy usuwające białka uszkodzone w wyniku stresu oksydacyjnego (1).

Zaburzenia stanu redoks, których nie mogą zrównoważyć mechanizmy antyoksydacyjne, mają bardzo poważne konsekwencje dla komórki. Uszkodzenia obejmują pęknięcia nici DNA oraz peroksydację lipidów i białek, która skutkuje uszkodzeniem mechanizmów transportu jonów, dezaktywacją enzymów oraz zaburzeniem struktury komórki (1). Najpoważniejsze konsekwencje ma proces karbonylacji białek (4). RFT powodują utlenianie aminokwasów wchodzących w skład bocznych łańcuchów polipeptydów. Utleniane mogą być wszystkie aminokwasy, ale najbardziej narażone są cysteina i metionina zawierające grupy tiolowe (4, 6). Proces utleniania tych dwóch aminokwasów jest również jedynym odwracalnym oksydacyjnym uszkodzeniem białek. Prawdopodobnie dlatego cysteina i metionina są pierwszym celem ataku RFT, a proces ich utleniania i redukcji służy jako mechanizm zabezpieczający pozostałe aminokwasy przed utlenianiem i ograniczający stopień nieodwracalnych zmian w łańcuchu polipeptydowym (6). Utlenianie aminokwasów prowadzi do niepożądanych reakcji pomiędzy łańcuchami bocznymi białek i tworzenia makrokompleksów, a także do fragmentacji cząsteczek białkowych (4, 6). Ponadto białka enzymatyczne stają się bardziej wrażliwe na proteolizę i wahania temperatury, zmienia się również ich aktywność katalityczna (6).

Karbonylację białek obserwowano podczas starzenia komórek i organizmów (około 1/3 białek podlega karbonylacji w podeszłym wieku) oraz w wielu chorobach, między innymi dystrofii mięśniowej, chorobie Alzheimera, artretyzmie, zaćmie, progerii, cukrzycy (6-8). Jest również najpowszechniej używanym wskaźnikiem stanu utlenienia białek, a co za tym idzie, markerem stanu redoks komórki (7). Wynika to między innymi z faktu, że grupy karbonylowe są stabilne chemicznie, co ułatwia przechowywanie próbek i wykrywanie badanych związków, ponadto karbonylacja zachodzi wkrótce po zadziałaniu czynnika utleniającego i pozwala wykryć zmiany stanu redoks na początkowym etapie (4, 7). Badanie stopnia karbonylacji białek wykorzystuje najczęściej reakcję grup karbonylowych ze związkiem o nazwie 2,4-dinitrofenylohydrazyna, której wynik wykrywa się spektrofotometrycznie, poprzez Western blot lub immunohistochemię (8).

Innym wskaźnikiem zaburzenia stanu redoks jest peroksydacja lipidów, polegająca na przyłączeniu tlenu do cząsteczki nienasyconego kwasu tłuszczowego (2). Podstawowym produktem utleniania lipidów jest dialdehyd malonowy (MDA) i większość testów wykrywa produkty jego reakcji z innymi związkami (4). Rosnącym zainteresowaniem cieszą się metody określania tzw. całkowitej pojemności antyoksydacyjnej (ang. total antioxidant capacity – TAC). Zasada różnorodnych testów określających TAC jest podobna – mierzy ilość moli związku utleniającego zneutralizowanego przez określoną objętość badanej próbki. W związku z tym, że w próbce występuje zestaw rozmaitych przeciwutleniaczy, test nie mierzy aktywności poszczególnych związków, ale wydolność antyoksydacyjną wszystkich tych mechanizmów razem, zgodnie z nazwą testu (9). Związek utleniający to najczęściej rodnik peroksylowy, jony żelaza w kompleksie o potencjale oksydacyjnym lub H₂O₂, a wynik reakcji jest wykrywany metodą fluorescencji lub spektrofotometrycznie (10).

Krwinki czerwone to komórki unikalne pod względem budowy, metabolizmu i funkcji. Również metabolizm reaktywnych form tlenu wyróżnia je spośród innych komórek, zarówno ze względu na szczególne narażenie erytrocytów na stres oksydacyjny, jak i z uwagi na dużą podatność krwinki na uszkodzenia związane z utlenianiem, powodujące znaczne zaburzenia jej struktury, upośledzenie funkcji i skrócenie czasu przeżycia. Podstawowym źródłem RFT w krwince czerwonej jest proces autoutleniania hemoglobiny. Wynikiem tej reakcji jest wytworzenie niefunkcjonalnej methemoglobiny (metHb) oraz anionorodnika ponadtlenkowego, natychmiast przekształcanego w H₂O₂ w reakcji katalizowanej przez SOD (11). W normalnych warunkach poziom metHb w krwince nie przekracza 1%, w sytuacji nasilonego lub przedłużającego się stresu oksydacyjnego zwiększa się on kilkukrotnie, dochodzi do reakcji krzyżowych pomiędzy łańcuchami globiny, które precypitują jako tzw. ciałka Heinza, a wreszcie hemolizy (4, 12). Proces autoutleniania hemoglobiny prowadzący do lizy krwinek czerwonych to rodzaj „samonapędzającego się” mechanizmu. Uwolniona metHb zwiększa wytwarzanie na zewnątrz komórki RFT, które dodatkowo zaburzają stan redoks innych erytrocytów. Nasilony stres oksydacyjny powoduje dalsze utlenianie hemoglobiny, hemolizę i uwalnianie kolejnych porcji metHb (12). Proces wytwarzania RFT nasilają dodatkowo atomy żelaza, uwalniane z uszkodzonych cząsteczek hemoglobiny. Reagują one z H₂O₂ wytwarzając reaktywny rodnik hydroksylowy (1, 2). Erytrocyty są dodatkowo narażone na działanie RFT wydzielanych przez neutrofile, makrofagi i komórki śródbłonka, na stres oksydacyjny w warunkach wysokiego ciśnienia tlenu oraz wpływ RFT produkowanych w wyniku ataku pasożytów (np. zarodźca malarii) lub działania leków (12, 13). Symptomy stresu oksydacyjnego widoczne w krwinkach czerwonych mogą być wskaźnikiem różnego rodzaju stanów patologicznych niezwiązanych bezpośrednio z krwinkami czerwonymi, ale wynikających z zaburzenia stanu redoks (13).