Karolina Jakubczyk1, Paweł Kwiatkowski2, Monika Sienkiewicz3, *Katarzyna Janda1
Zawartość polifenoli w ekstraktach z podagrycznika pospolitego (Aegopodium podagraria L.) oraz ich aktywność przeciwgronkowcowa
The content of polyphenols in extract from goutweed (Aegopodium podagraria L.) and their antistaphylococcal activity
1Zakład Biochemii i Żywienia Człowieka, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie
Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Ewa Stachowska
2Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie
Kierownik Katedry: prof. dr hab. n. med. Barbara Dołęgowska
3Zakład Alergologii i Rehabilitacji Oddechowej, II Katedra Otolaryngologii, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. Hanna Zielińska-Bliźniewska, prof. nadzw.
Streszczenie
Wstęp. Metabolity roślinne mają cenne właściwości farmakologiczne, w tym przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe i przeciwgrzybicze. Podagrycznik pospolity (Aegopodium podagraria L.), jako szeroko rozpowszechniona roślina, od dawnych czasów używany był do leczenia oparzeń, ran i stanów zapalnych. Zgodnie z danymi piśmiennictwa, preparaty otrzymane z gatunku Aegopodium podagraria L. rosnącego w różnych regionach geograficznych wykazują właściwości przeciwbakteryjne.
Cel pracy. Celem badań była ocena ogólnej zawartości polifenoli w ekstraktach pozyskanych z podagrycznika pospolitego w zależności od temperatury ekstrakcji oraz zbadanie ich właściwości przeciwgronkowcowych.
Materiał i metody. Liście, kwiaty, nasiona i kłącza podagrycznika pospolitego oczyszczono, zamrożono i zliofilizowano. Materiał roślinny poddano ekstrakcji etanolem przez 3 godz. w temp. 80°C oraz w 25°C w łaźni wodnej. Do badań mikrobiologicznych wykorzystano szczep referencyjny oraz szczep kliniczny S. aureus. Testy wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki przeprowadzono metodą dyfuzyjno-krążkową. Minimalne stężenie hamujące (MIC) dla gentamycyny wyznaczono metodą E-test. MIC dla ekstraktów etanolowych określono metodą mikrorozcieńczeń w podłożu płynnym, przy czym jako wskaźnik zastosowano resazurynę.
Wyniki. Badania wykazały, że całkowita zawartość polifenoli w ekstraktach etanolowych pozyskanych z różnych części morfologicznych podagrycznika jest zależna od temperatury ekstrakcji. Dowiedziono, że wszystkie ekstrakty etanolowe wykazują właściwości hamujące wzrost szczepu referencyjnego i klinicznego S. aureus w stężeniu 64 mg/ml.
Wnioski. Nasze badania zwracają uwagę na wpływ warunków ekstrakcji, znaczenie części morfologicznej rośliny oraz warunków uprawy na zawartość metabolitów roślinnych – związków polifenolowych w surowcach pozyskanych z podagrycznika pospolitego. Ekstrakty etanolowe z Aegopodium podagraria L. ze względu na właściwości przeciwbakteryjne mogą być użyteczne jako dodatek do preparatów stosowanych w zakażeniach szczepami gronkowca złocistego.
Summary
Introduction. Various plant secondary metabolites produce valuable pharmacological effects, demonstrating antibacterial, antiviral and antifungal properties. Goutweed, as very widespread plant, for a very long time was used to treat of burns, wounds and different inflammations. According data of literature raw materials obtained from Aegopodium podagraria L. growing in different geographical origin have antibacterial activity.
Aim. The aim of the study was to evaluate the overall content of polyphenols in plant materials from goutweed depending on the temperature of extraction and to check their antistaphylococcal properties.
Material and methods. Leaves, flowers, seeds and rhizomes of goutweed were purified, frozen and lyophilized. Plant material was subjected to extraction for 3 hours at 80°C and 25°C in a water-bath. For the microbiological tests the reference and clinical strain of S. aureus were used. Susceptibility testing to antibiotics and chemotherapeutics for bacteria was carried out using disc-diffusion method. The minimal inhibitory concentration (MIC) values for gentamicin were detected by use of E-test. MIC for the ethanolic extracts was established by the microdilution broth method with use of resazurin.
Results. The results of experiments showed that the overall content of polyphenols in the ethanolic extracts from different organs of Aegopodium podagraria L. depends on the temperature of extraction. Research found that all tested extracts show inhibiting activity against reference and clinical strain of S. aureus with MIC value 64 mg/ml.
Conclusions. Our investigations draw attention on the impact of the conditions of extraction and also in the relation to the literature, to the geographical conditions on the content of plant metabolites – polyphenols in the different raw materials from goutweed. Ethanolic extracts from Aegopodium podagraria L. because of the inhibiting activity can be helpful as addition to preparations used in the treatment of staphylococcal infections.
Wprowadzenie
Podagrycznik pospolity (Aegopodium podagraria L.) jest powszechnie spotykaną rośliną należącą do rodziny selerowatych (Apiaceae). Występuje w całej Europie i Ameryce Północnej (1-3). Roślina ta rozmnaża się za pomocą kłączy i rozłogów, jest odporna na mróz. Odznacza się przy tym dużą konkurencyjnością w stosunku do innych gatunków, dzięki czemu szybko opanowuje teren, z czym wiąże się dobra dostępność i łatwość pozyskiwania surowca.
Skład chemiczny A. podagraria jest stosunkowo słabo poznany (4). W świetle najnowszych badań najważniejszą grupą związków chemicznych wydają się być poliacetyleny: falkarinol, falkarindiol, falkarinon oraz falkarinolon (4, 5). Drugą istotną grupą związków chemicznych obecnych w podagryczniku są olejki eteryczne, zawierające głównie mono- i seskwiterpeny (6). Gatunek ten ceniony jest także jako źródło witamin oraz makro- i mikroelementów, m.in. żelaza, miedzi, manganu, tytanu, boru, wapnia i potasu (1). W podagryczniku występują również związki fenolowe z grupy kumaryn, kwasów fenolowych i flawonoidów (3, 4, 7).
Podagrycznik stosowany był w medycynie ludowej od czasów starożytnych, przede wszystkim w leczeniu chorób reumatycznych, dny moczanowej i rwy kulszowej. Roślina ta wykazuje działanie uspokajające, moczopędne, przeciwzapalne, przeciwdrobnoustrojowe oraz przeciwutleniające (3, 5, 7-9). Zgodnie z danymi piśmiennictwa napar z ziela to lek zalecany w leczeniu podagry, żylaków odbytu, stanów zapalnych nerek i pęcherza moczowego, pomocniczo w kamicy nerkowej, a także poprawiający przemianę materii. Natomiast świeże liście przykładane na rany powodują szybsze ich gojenie (3, 7).
Dostępne piśmiennictwo donosi o bezpieczeństwie stosowania podagrycznika pospolitego. Wynika to z dużej rozpiętości pomiędzy dawką terapeutyczną i toksyczną głównego czynnego związku zawartego w roślinie (falkarinolu), co pozwala na stosowanie surowca bez ryzyka wystąpienia działań niepożądanych (4, 5).
Gronkowce złociste (Staphylococcus aureus) należą do bakterii Gram-dodatnich, względnie beztlenowych i katalazo-dodatnich (10). Są one bardzo wytrzymałe na wysychanie, poza ustrojem mogą przeżyć nawet wiele tygodni (11).
S. aureus jest od wielu lat jednym z podstawowych drobnoustrojów chorobotwórczych odpowiedzialnych za zakażenia szpitalne i pozaszpitalne u ludzi; często są to zakażenia inwazyjne o ciężkim lub umiarkowanym przebiegu. Zakażenia te dotyczą przede wszystkim skóry i tkanki podskórnej, zwykle z udziałem procesu ropnego (12). Najbardziej powszechne są ropne zakażenia skóry, takie jak: liszajec, czyraczność, trądzik, jęczmień, zapalenie mieszków włosowych, gruczołów potowych, gruczołu mlekowego oraz zakażenia ran pooperacyjnych (10, 12).
Gronkowce złociste charakteryzuje zdolność do łatwego nabywania oporności na antybiotyki, dlatego stwarzają one duże zagrożenie dla zdrowia i życia człowieka (13). W większości przypadków dotychczasowe metody leczenia antybiotykami z grupy penicylin są nieskuteczne, co utrudnia terapię zakażeń o etiologii gronkowcowej, stąd powierzchowne zakażenia skóry są nadal wyzwaniem dla klinicystów (13).
Problem narastającej oporności bakterii na antybiotyki skłania środowisko naukowe do poszukiwania alternatywnych sposobów leczenia zakażeń wywoływanych przez wielolekooporne gronkowce. Odpowiedzią na to zapotrzebowanie mogą być surowce roślinne bogate w związki bioaktywne o działaniu przeciwbakteryjnym, które mogą stanowić cenne uzupełnienie terapii konwencjonalnej.
Rośliny z rodziny Apiaceae, w tym podagrycznik pospolity, są bogatym źródłem związków poliacetylenowych oraz kumaryn o działaniu przeciwbakteryjnym. Istotne jest poszukiwanie optymalnych warunków uprawy oraz ich otrzymywania z surowca roślinnego, które pozwolą na uzyskanie ekstraktów o wysokiej zawartości tych związków, a tym samym lepszej aktywności przeciwdrobnoustrojowej.
Cel pracy
Celem pracy była ocena ogólnej zawartości związków polifenolowych w ekstraktach z kwiatów, kłączy, nasion i liści podagrycznika pospolitego w zależności od warunków ekstrakcji z surowca roślinnego oraz zbadanie właściwości przeciwbakteryjnych pozyskanych ekstraktów wobec S. aureus.
Materiał i metody
Materiał roślinny
Materiał roślinny do badań stanowiły części nadziemne (liście, kwiaty, nasiona) oraz podziemne (kłącza) podagrycznika pospolitego zbierane w okresie od maja do października 2016 roku, w okresach optymalnych dla pozyskiwania poszczególnych organów roślinnych. Bezpośrednio po zbiorze materiał został oczyszczony, zamrożony oraz poddany liofilizacji (Alpha 1-2 LD Plus, 0,735 mm Hg, -20°C), a następnie roztarciu w moździerzu do postaci proszku.
Przygotowanie ekstraktu etanolowego
Do sproszkowanego suchego materiału roślinnego dodano alkohol etylowy (Chempur). Ekstrakcję prowadzono przez 3 godz. w temp. 80°C oraz 25°C w łaźni wodnej, ekstrakty pozostawiono w ciemnym miejscu na 24 godz., a następnie alkohol oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem.
Oznaczenie ogólnej zawartości polifenoli
Do fiolki wprowadzano kolejno: roztwór Folina-Ciocalteu (Chempur), próbę badaną o stężeniu 100 ppm oraz etanol jako rozpuszczalnik (Chempur). Próbki wytrząsano przez 5 min, a następnie dodawano do nich 7,5% Na2CO3 (Chempur). Sporządzony roztwór po wymieszaniu inkubowano przez 60 min w temperaturze pokojowej. Przed przystąpieniem do pomiaru kalibrowano spektrofotometr na drodze pomiaru absorbancji przy długości fali λ = 765 nm. Używano roztworu referencyjnego, zawierającego: wodę destylowaną, roztwór Folina-Ciocalteu oraz 7,5% Na2CO3. Następnie wykonano pomiar wobec próby referencyjnej. Przed pomiarem zawartość fiolki dokładnie mieszano, przelewano do kuwet i niezwłocznie dokonywano pomiaru widma absorbancji. Wszystkie oznaczenia wykonano w trzech powtórzeniach. Zawartość polifenoli określano w przeliczeniu na kwas galusowy (14). Oznaczenia aktywności przeciwutleniającej badanych ekstraktów przeprowadzano przy użyciu spektrofotometru UV-Vis Agilent 8453.
Szczepy bakteryjne
W badaniu wykorzystano szczep kliniczny S. aureus wyizolowany z trudno gojącej się rany. Jako szczep wzorcowy użyto S. aureus ATCC 29213. Bakterie posiewano na podłoża Chapmana oraz Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej (bioMerièux), następnie inkubowano je w temp. 37°C przez 24 godz. w warunkach tlenowych. Przy identyfikacji bakterii uwzględniano morfologię komórek w preparacie barwionym metodą Grama, morfologię kolonii z określeniem hemolizy na podłożu krwawym oraz rozkład mannitolu. Biochemiczną identyfikację izolatu przeprowadzono przy użyciu zautomatyzowanego systemu Vitek 2 Compact (bioMèrieux). Badania identyfikacji wykonywano zgodnie z instrukcjami wytwórcy systemu, wykorzystując karty identyfikacji bakterii (GP).
Oznaczenie wrażliwości S. aureus na wybrane antybiotyki i chemioterapeutyki
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Olechnowicz-Stępień W, Lamer-Zarawska E. Rośliny lecznicze stosowane u dzieci. PZWL, Warszawa 1989.
2. Strzelecka H, Kowalski J. Encyklopedia zielarstwa i ziołolecznictwa. PWN, Warszawa 2000.
3. Stefanovic O, Comic L, Stanojevic D i wsp. Antibacterial activity of Aegopodium podagraria L. extracts and interaction between extracts and antibiotics. Turk J Biol 2009; 33:145-50.
4. Kunstman P, Wojcińska M, Popławska P. Podagrycznik pospolity (Aegopodium podagraria L.). Post Fitoter 2012; (4):244-9.
5. Christensen LP, Brandt K. Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: occurrence, bioactivity and analysis. J Pharm Biomed Anal 2006; 41:683-93.
6. Kapetanos C, Karioti A, Bojović S i wsp. Chemical and principal-component analyses of the essential oils of Apioideae taxa (Apiaceae) from central Balkan. Chem Biodivers 2008; 5:101-19.
7. Trąba C, Rogut K, Wolański P. Rośliny dziko występujące i ich zastosowanie. Przewodnik po wybranych gatunkach. Procapathia, Rzeszów 2012.
8. Prior RM, Lundgaard NH, Light ME i wsp. The polyacetylene falcarindiol with COX-1 activity isolated from Aegopodium podagraria L. J Ethnopharmacol 2007; 113:176-8.
9. Valyova M, Tashev A, Stoyanov S i wsp. In vitro free-radical scavenging activity of Aegopodium podagraria L. and Orlaya grandiflora (L.) Hoffm. (Apiaceae). J Chem Technol Metall 2016; 51:271-4.
10. Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clin Microbiol Rev 1997; 10:505-20.
11. Jawetz E, Melnick JL, Adalberg EA. Przegląd mikrobiologii lekarskiej. PZWL, Warszawa 1991.
12. Berk DR, Bayliss SJ. MRSA, staphylococcal scalded skin syndrome, and other cutaneous bacterial emergencies. Pediatr Ann 2010; 39:627-33.
13. Kwiatkowski P, Mnichowska-Polanowska M, Pruss A i wsp. Activity of essential oils against Staphylococcus aureus strains isolated from skin lesions in the course of staphylococcal skin infections. Herba Pol 2017; 63:43-52.
14. Abdelhady MIS, Motaal AA, Beerhues L. Total phenolic content and antioxidant activity of standardized extracts for leaves and cell cultures of three Callistemon species. Am J Plant Sci 2011; 2:847-50.
15. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoints tables for interpretation of MICs and zones diameters. Version 5.0, 2015. http://www.eucast.org.
16. CLSI: Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Approved Standard. 9th ed. CLSI document M07-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne 2012.
17. Iwu MW, Duncan AR, Okunji CO. New antimicrobials of plant origin. [In:] Janick J (ed.). Perspectives on New Crops and New Uses. ASHS Press, Alexandria 1999; 457-62.
18. Cowan MM. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 1999; 12:564-82.
19. Stołowska M, Kłobus G. Charakterystyka flawonoidów i ich rola w kosmetyce i terapii. Post Kosmetol 2010; 1:8-12.
20. Redo MC, Rios JL, Villar A. A review of some antimicrobial compounds isolated from medicinal plants reported in the literature 1978-88. Phytother Res 1989; 3:117-25.
21. Ojala T, Remes S, Haansuu P i wsp. Antimicrobial activity of some coumarin containing herbal plants growing in Finland. J Ethnopharmacol 2000; 73:299-305.
22. Duško BL, Čomić L, Solujić-Sukdolak S. Antibacterial activity of some plants from family Apiaceae in relation to selected phytopathogenic bacteria. Kragujevac J Sci 2006; 28:65-72.
