*Magdalena Woźniak1, Patrycja Kwaśniewska-Sip2, Marta Babicka1, Agnieszka Waśkiewicz1, Grzegorz Cofta2, Bogdan Kędzia3, Izabela Ratajczak1
Skład chemiczny etanolowego ekstraktu z propolisu i jego aktywność biologiczna wobec grzybów pleśniowych
The chemical composition of the ethanolic propolis extract and its biological activity against moulds
1Katedra Chemii, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
Kierownik Katedry: dr hab. nauk leśnych Izabela Ratajczak
2Instytut Chemicznej Technologii Drewna, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. nauk leśnych Bartłomiej Mazela
3Instytut Włókien Naturalnych i Roślin Zielarskich, Poznań
Dyrektor Instytutu: dr n. ekon. Robert Sobków
Streszczenie
Wstęp. Propolis jest naturalnym surowcem, którego ekstrakty wykazują liczne właściwości biologiczne, w tym przeciwgrzybicze, przeciwbakteryjne, przeciwutleniające i przeciwnowotworowe. Związki fenolowe (flawonoidy oraz kwasy fenolowe i ich estry) są jedną z najczęściej wymienianych grup składników propolisu odpowiedzialnych za aktywność biologiczną ekstraktów z propolisu. Inną grupą składników identyfikowaną w propolisie są pierwiastki, w tym makro- i mikroelementy, oraz metale ciężkie.
Cel pracy. Celem pracy było określenie aktywności biologicznej etanolowego ekstraktu z propolisu pochodzącego z województwa warmińsko-mazurskiego wobec grzybów pleśniowych i analiza ilościowa wybranych związków flawonoidowych oraz pierwiastków zawartych w ekstrakcie.
Materiał i metody. Aktywność biologiczną ekstraktu z propolisu otrzymanego z surowca pochodzącego z województwa warmińsko-mazurskiego wobec grzybów pleśniowych określono metodą rozcieńczeń w pożywce. Zawartość wybranych flawonoidów (apigenina, pinocembryna, kemferol i galangina) w ekstrakcie z propolisu oznaczono, wykorzystując ultrasprawną chromatografię cieczową z detekcją fotodiodową oraz masową. Stężenie pierwiastków w ekstrakcie oznaczono, stosując spektrometrię absorbcji atomowej z atomizacją w płomieniu.
Wyniki. Ekstrakt z propolisu charakteryzował się aktywnością wobec wszystkich badanych szczepów grzybów pleśniowych. Najwyższą aktywność wykazywał wobec Chaetomium globosum i Penicillium cyclopium. Spośród oznaczanych flawonoidów w najwyższym stężeniu występowała pinocembryna. Ponadto w ekstrakcie z propolisu oznaczono wysoki poziom Na, Mg, K, Ca i Fe. Nie stwierdzono obecności toksycznych metali ciężkich.
Wnioski. Etanolowy ekstrakt z propolisu krajowego wykazuje aktywność biologiczną względem testowych grzybów pleśniowych oraz stanowi cenne źródło flawonoidów, a także makro- i mikroelementów.
Summary
Introduction. Propolis is a natural material whose extracts indicate numerous biological activities, including antifungal, antibacterial, antioxidant and anticancer. Phenolic compounds (flavonoids as well as phenolic acids and their esters) are one of the most frequently mentioned group of propolis components responsible for the biological activity of propolis extracts. Another group of components identified in propolis is elements, including macro- and microelements as well as heavy metals.
Aim. The aim of the study was to determine the biological activity of the ethanolic propolis extract originated form Warmian-Masurian Voivodeship against moulds and to analyze concentration of selected flavonoids and elements present in the extract.
Material and methods. The biological activity of the propolis extract obtained from a raw propolis originated from Warmian-Masurian Voivodeship against moulds was determined by dilution in nutrient solution. The content of selected flavonoids (apigenin, pinocembrin, kaempferol and galangin) in the propolis extract was determined using ultra-performance liquid chromatography photodiode array detection tandem mass spectrometric method. The concentration of elements in the propolis extract was analyzed by flame atomic absorption spectrometry.
Results. The propolis extract was characterized by activity against all tested fungal strains. It showed the highest activity towards Chaetomium globosum and Penicillium cyclopium. Among analyzed flavonoids, the highest concentration in the propolis extract was determined for pinocembrin. In addition, high concentrations of Na, Mg, K, Ca and Fe were found in the propolis extract, and no toxic heavy metals were found.
Conclusions. The ethanolic propolis extract of national origin shows biological activity against tested moulds and it is a valuable source of flavonoids, as well as macro- and microelements.
Wprowadzenie
Propolis jest naturalnym produktem, którego ekstrakty dzięki licznym właściwościom biologicznym znajdują zastosowanie w wielu dziedzinach, takich jak przemysł spożywczy, farmaceutyczny czy kosmetyczny (1-3).
Najwięcej doniesień piśmiennictwa dotyczących propolisu skupia się wokół analizy jego składu chemicznego oraz na określeniu aktywności przeciwgrzybiczej, przeciwbakteryjnej, przeciwutleniającej i przeciwnowotworowej jego ekstraktów (1-7). Wyniki badań wskazują, że ekstrakty z propolisu hamują rozwój wielu gatunków grzybów. Przykładem tego jest etanolowy ekstrakt z propolisu argentyńskiego powodujący zahamowanie rozwoju m.in. Schizophyllum commune, Penicillium notatum czy Fusarium oxysporum, a także etanolowe oraz metanolowe ekstrakty z propolisu słowackiego, które hamowały rozwój Aspergillus flavus, Geotrichum candidum i różnych gatunków z rodzaju Candida (8, 9). Z kolei etanolowe ekstrakty z propolisu pochodzącego z różnych regionów geograficznych (m.in. z Kolumbii, Polski i Włoch) powodowały zahamowanie rozwoju Trichoderma viride, A. niger, P. chrysogenum i Saccharomyces cerevisiae (10). Natomiast etanolowe ekstrakty z propolisu tureckiego w stężeniu 10% całkowicie hamowały wzrost A. versicolor i P. aurantiogriseum, czyli gatunków rozwijających się na produktach spożywczych i odpowiedzialnych za biosyntezę mykotoksyn (11).
Według danych piśmiennictwa aktywność biologiczna, w tym także aktywność przeciwgrzybicza, ekstraktów z propolisu związana jest z synergistycznym działaniem jego wszystkich składników, jednak jedną z najczęściej wymienianych grup związków, które mogą odpowiadać za tę aktywność, są związki fenolowe (flawonoidy oraz kwasy fenolowe i ich estry), a także terpeny i inne składniki identyfikowane we frakcji lotnej propolisu (9, 12-17). Wykazano, że w próbkach propolisu pochodzącego z różnych regionów świata odmienne grupy związków odpowiedzialne są za jego właściwości biologiczne (18, 19). Peng i wsp. (20) podają, że pinocembryna wyizolowana z propolisu hamowała rozwój P. italicum, natomiast Yang i wsp. (17) stwierdzili, że za właściwości przeciwgrzybicze ekstraktów z propolisu względem P. italicum odpowiedzialne mogą być, poza pinocembryną, także inne flawonoidy – galangina, pinostrobina i chryzyna, które zidentyfikowano we frakcji surowca charakteryzującej się najwyższą aktywnością przeciwgrzybiczą. W innych badaniach Aguero i wsp. (12) wyizolowali z frakcji argentyńskiego propolisu, odznaczającej się najwyższą aktywnością przeciwgrzybiczą, 5 związków: chryzynę, pinocembrynę, galanginę, kwas 3-metylo-nordihydrogwajaretowy (MNGDA) oraz kwas nordihydrogwajaretowy (NDGA) i analizowali ich właściwości przeciwgrzybicze. Kwasy NDGA i MNDGA wykazywały silne właściwości przeciwgrzybicze wobec Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum i T. rubrum, a NDGA dodatkowo powodował zahamowanie rozwoju Candida albicans, C. tropicalis i Cryptococcus neoformans. Spośród flawonoidów galangina i pinocembryna wykazały działanie hamujące wzrost C. albicans, C. tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, C. neoformans, a dodatkowo wobec T. mentagrophytes i T. rubrum podobną aktywność wykazywała galangina. Natomiast, chryzyna charakteryzowała się niewielką zdolnością hamowania rozwoju wszystkich gatunków grzybów użytych w badaniach (12).
Ważnym zagadnieniem w przypadku stosowania ekstraktów z propolisu w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym czy kosmetycznym jest analiza ich składu chemicznego, której celem jest wykazanie, czy dany ekstrakt nie zawiera szkodliwych dla zdrowia składników, w tym metali ciężkich. Dane piśmiennictwa wskazują, że w propolisie pochodzącym z Chile, Rosji i Hiszpanii stwierdzono obecność kadmu, ołowiu, chromu i niklu (21, 22). Również propolis pochodzący z Chin i Polski zawierał metale szkodliwe dla zdrowia (23, 24). Według danych piśmiennictwa stężenie pierwiastków w ekstraktach propolisu jest niższe niż w surowcu, z którego ekstrakty te są otrzymywane (24, 25).
Cel pracy
Celem pracy było określenie aktywności biologicznej wobec grzybów pleśniowych i oznaczenie stężenia wybranych związków flawonoidowych oraz pierwiastków w etanolowym ekstrakcie z propolisu pochodzącym z województwa warmińsko-mazurskiego.
Materiał i metody
Ekstrakt z propolisu
Wykorzystany w badaniach ekstrakt z propolisu otrzymano w wyniku ekstrakcji surowca pochodzącego z województwa warmińsko-mazurskiego za pomocą 96% alkoholu etylowego (Avantor Performance Materials Poland S.A.) w stosunku 1:10 (m/v). Proces ekstrakcji prowadzony był przez okres 5 dni w temperaturze pokojowej i bez dostępu światła, z wykorzystaniem wytrząsarki (Biosan). Po tym czasie ekstrakt przesączono i umieszczono w temperaturze 4°C w celu wytrącenia wosków, a następnie ponownie przesączono i odparowano rozpuszczalnik z wykorzystaniem wyparki próżniowej (Buchi Labortechnik AG). Zagęszczony ekstrakt wykorzystywano do dalszych analiz biologicznych i chemicznych.
Oznaczenie aktywności przeciwgrzybiczej
W badaniach wykorzystano 8 szczepów grzybów pleśniowych: Aspergillus niger ATCC 6275, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans ATCC 9348, Chaetomium globosum ATCC 6205, Paecilomyces variotii ATCC 9645, Penicillium cyclopium, Penicillium funiculosum ATCC 11797 i Trichoderma virens ATCC 9645. Szczepy grzybów testowych przechowywano na pożywkach stałych w temperaturze 4-6°C, przeszczepiając je raz w miesiącu na świeże podłoże agarowe Czapek-Doxa (Sigma-Aldrich), w celu zachowania czystości hodowli.
Aktywność przeciwgrzybiczą badanego ekstraktu z propolisu wobec gatunków grzybów testowych określono metodą rozcieńczeń w pożywce płynnej. Zagęszczony ekstrakt z propolisu rozpuszczono ponownie w 96% alkoholu etylowym, uzyskując stężenie 100 mg/ml. Z tego roztworu przygotowywano rozcieńczenia w płynnym podłożu Sabouraud Dextrose Broth (Sigma-Aldrich) w zakresie stężeń 0,5-10 mg/ml. Następnie do każdego z rozcieńczeń o objętości 1 ml dodawano po 0,1 ml zawiesiny każdego z badanych szczepów grzybów zawieszonych w tym samym podłożu płynnym co ekstrakt z propolisu. Liczba dodawanych zarodników mieściła się w zakresie 104-105 w 1 ml, co określono za pomocą komory Thoma. Inkubację prowadzono w temperaturze 27 ± 2°C przez okres 7 dni. Po tym czasie określano najmniejsze stężenie ekstraktu propolisu powodujące zahamowanie rozwoju badanego szczepu grzyba MIC (ang. minimal inhibitory concentration) oraz całkowite zahamowanie rozwoju określone jako minimalne stężenie grzybobójcze MFC (ang. minimal fungicidal concentration). Wartości te wyrażano w mg/ml. Jako substancję referencyjną zastosowano 4,5-dichloro-2-oktylo-2H-izotiazol-3-on.
Oznaczenie stężenia flawonoidów
Powyżej zamieściliśmy fragment artykułu, do którego możesz uzyskać pełny dostęp.
Mam kod dostępu
- Aby uzyskać płatny dostęp do pełnej treści powyższego artykułu albo wszystkich artykułów (w zależności od wybranej opcji), należy wprowadzić kod.
- Wprowadzając kod, akceptują Państwo treść Regulaminu oraz potwierdzają zapoznanie się z nim.
- Aby kupić kod proszę skorzystać z jednej z poniższych opcji.
Opcja #1
29 zł
Wybieram
- dostęp do tego artykułu
- dostęp na 7 dni
uzyskany kod musi być wprowadzony na stronie artykułu, do którego został wykupiony
Opcja #2
69 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 30 dni
- najpopularniejsza opcja
Opcja #3
129 zł
Wybieram
- dostęp do tego i pozostałych ponad 7000 artykułów
- dostęp na 90 dni
- oszczędzasz 78 zł
Piśmiennictwo
1. Castaldo S, Capasso F. Propolis, an old remedy used in modern medicine. Fitoter (suppl. 1) 2002; S1-S6.
2. Toreti VC, Sato HH, Pastore GM i wsp. Recent progress of propolis for its biological and chemical compositions and its botanical origin. Evid Based Compl Alt 2013.
3. Banskota AH, Tezuka Y, Kadota S. Recent progress in pharmacological research of propolis. Phytother Res 2001; 15:561-71.
4. Kędzia B, Hołderna-Kędzia E. Aktywność antybiotyczna propolisu krajowego i europejskiego. Post Fitoter 2013; 2:97-107.
5. Szliszka E, Sokół-Łętowska A, Kucharska AZ i wsp. Ethanolic extract of Polish propolis: chemical composition and TRAIL-R2 death receptor targeting apoptotic activity against prostate cancer cells. Evid Based Compl Alt 2013.
6. Kumazawa S, Hamasaka T, Nakayama T. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins. Food Chem 2004; 84:329-39.
7. Wagh VD. Propolis: A wonder bees product and its pharmacological potentials. Evid Based Compl Alt Vol 2013.
8. Kacaniova M, Vukovic N, Chlebo R i wsp. The antimicrobial activity of honey, bee pollen loads and beeswax from Slovakia. Arch Biol Sci 2012; 64(3):1545-57.
9. Quiroga EN, Sampietro DA, Soberon JR i wsp. Propolis from the northwest of Argentina as a source of antifungal principles. J Appl Microbiol 2006; 101:103-10.
10. Garedew A, Schmolz E, Lamprecht I. Microbiological and calorimetric investigations on the antimicrobial actions of different propolis extracts: an in vitro approach. Thermochim Acta 2004; 422:115-24.
11. Temiz A, Mumcu AS, Ozkok A i wsp. Antifungal activity of propolis samples collected from different geographical regions of Turkey against food-related molds, Aspergillus versicolor and Penicillium aurantiogriseum. Gida 2013; 38(3):135-42.
12. Aguero MB, Svetaz L, Baroni V i wsp. Urban propolis from San Juan province (Argentina): Ethnopharmacological uses and antifungal activity against Candida and dermatophytes. Ind Crop Prod 2014; 57:166-73.
13. Aguero MB, Gonzalez M, Lima B i wsp. Argentinean propolis from Zuccagnia punctate Cav. (Caesalpinieae) exudates: phytochemical characterization and antifungal activity. J Agric Food Chem 2010; 58:194-201.
14. Kartal M, Yildiz S, Kaya S i wsp. Antimicrobial activity of propolis samples from two different regions of Anatolia. J Ethnopharmacol 2003; 86:69-73.
15. Meneses EA, Durango DL, Garcia CM. Antifungal activity against postharvest fungi by extracts from Colombian propolis. Quim Nova 2009; 32(8):2011-7.
16. Popova MP, Chinou IB, Marekov IN i wsp. Terpenes with antimicrobial activity from Cretan propolis. Phytochemistry 2009; 70:1262-71.
17. Yang SZ, Peng LT, Su XJ i wsp. Bioassay-guided isolation and identification of antifungal components from propolis against Penicillium italicum. Food Chem 2011; 127:210-5.
18. Kujumgiev A, Tsvetkova I, Serkedjieva Y i wsp. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J Ethnopharmacol 1999; 64:235-40.
19. Silici S, Unlu M, Vardar-Unlu G. Antibacterial activity and phytochemical evidence for the plant origin of Turkish propolis from different regions. World J Microbiol Biotechnol 2007; 23:1797-803.
20. Peng L, Yang S, Cheng YJ i wsp. Antifungal activity and action mode of pinocembrin from propolis against Penicillium italicum. Food Sci Biotechnol 2012; 21(6):1533-9.
21. Golubkina NA, Sheshnitsan SS, Kapitalchuk M i wsp. Variations of chemical element composition of bee and beekeeping products in different taxons of the biosphere. Ecol Indic 2016; 66:452-7.
22. Gonzalez-Martin MI, Escuredo O, Revilla I i wsp. Determination of the mineral composition and toxic element contents of propolis by near infrared spectroscopy. Sensors 2015; 13:27854-68.
23. Gong S, Luo L, Gong W i wsp. Multivariate analyses of element concentrations revealed the groupings of propolis from different regions in China. Food Chem 2012; 134:583-8.
24. Kędzia B, Gnusowski B, Mścisz A i wsp. Badanie zawartości metali szkodliwych dla zdrowia w propolisie i koncentracie propolisowym. Mat z XXXVIII Nauk Konf Pszczel, Puławy 2001.
25. Woźniak M, Ratajczak I, Kędzia B i wsp. Zawartość wybranych pierwiastków w propolisie i jego etanolowym ekstrakcie. Post Fitoter 2016; 17(1):3-7.
26. Woźniak M, Ratajczak I, Kwaśniewska P i wsp. Badanie aktywności ekstraktów propolisowych wobec wybranych gatunków grzybów pleśniowych. Post Fitoter 2015; 16(4):205-9.
27. Medana C, Carbone F, Aigotti R i wsp. Selective analysis of phenolic compounds in propolis by HPLC-MS/MS. Phytochem Anal 2008; 19:32-9.
28. Papotti G, Bertelli D, Bortolotti L i wsp. Chemical and functional characterization of Italian propolis obtained by different harvesting methods. J Agric Food Chem 2012; 60:2852-62.
29. Ahn MR, Kumazawa S, Usui Y i wsp. Antioxidant activity and constituents of propolis collected in various areas of China. Food Chem 2007; 101:1383-92.
30. Kumazawa S, Bonvehi JS, Torres C i wsp. Chemical and functional characterisation of propolis collected from East Andalusia (Southern Spain). Phytochem Anal 2013; 24:608-15.
31. Kędzia B. Skład chemiczny i aktywność biologiczna propolisu pochodzącego z różnych regionów świata. Post Fitoter 2006; (1):23-35.
32. Kędzia B. Skład chemiczny propolisu polskiego. Cz. I. Początkowy okres badań. Post Fitoter 2009; (1):39-44.
33. Kędzia B. Skład chemiczny propolisu polskiego. Cz. II. Nowe badania. Post Fitoter 2009; (2):122-8.
34. Socha R, Gałkowska D, Bugaj M i wsp. Phenolic composition and antioxidant activity of propolis from various regions of Poland. Nat Prod Res 2015; 29(5):416-22.
35. Kaleta J. Analiza fizykochemiczna propolisu i możliwości jego standaryzacji. Praca doktorska. Uniwersytet Jagielloński, Collegium Medicum, Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Kraków 2007.
36. PN-A-77627 (1996): Koncentrat propolisu.
